裴艷剛　朱宇航　歲立云等

中圖分類(lèi)號(hào)：S 481.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020229科普愛(ài)好者提供一個(gè)便捷準(zhǔn)確的外來(lái)入侵植物自動(dòng)識(shí)別和調(diào)查工具，大大降低了經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本。調(diào)查監(jiān)測(cè)人員或用戶可以通過(guò)該APP系統(tǒng)隨時(shí)隨地拍攝入侵植物圖像并上傳到云服務(wù)器，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了用戶點(diǎn)對(duì)點(diǎn)服務(wù)，實(shí)現(xiàn)外來(lái)入侵植物信息查詢、圖像自動(dòng)識(shí)別、入侵植物采集點(diǎn)地圖顯示和專(zhuān)家遠(yuǎn)程鑒定、圖像識(shí)別歷史查詢等功能。目前對(duì)35科135種入侵植物平均識(shí)別率達(dá)到85. 3%，可在1～2s內(nèi)將識(shí)別結(jié)果反饋至用戶客戶端。由于一部分入侵植物圖像來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，圖像質(zhì)量不高，以及部分種類(lèi)的入侵植物的圖片收集不全等，影響了入侵植物的準(zhǔn)確識(shí)別率。后續(xù)的研究，一方面需要提高入侵植物的圖片質(zhì)量和樣本量，包括入侵植物在不同生境和發(fā)育階段的圖片;另一方面，針對(duì)一些入侵植物存在多種本地同屬近緣種或形態(tài)相似種的情況，還需要增加本地植物圖片庫(kù)，以進(jìn)一步提升入侵植物的識(shí)別精度和識(shí)別率。但針對(duì)一些目前形態(tài)識(shí)別不準(zhǔn)的入侵植物，該系統(tǒng)的后臺(tái)專(zhuān)家實(shí)時(shí)支撐系統(tǒng)則明顯彌補(bǔ)了這一不足，并且通過(guò)大量圖片的不斷積累，也增加了后續(xù)識(shí)別的精度。

我國(guó)外來(lái)入侵植物種類(lèi)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止本研究識(shí)別采樣的種類(lèi)數(shù)，調(diào)查人員利用本系統(tǒng)調(diào)查和拍攝入侵植物的圖像識(shí)別，記錄了識(shí)別入侵植物的種類(lèi)和發(fā)生位置，后期可以通過(guò)大數(shù)據(jù)挖掘與分析獲得各地的入侵植物發(fā)生、分布和危害情況，這對(duì)我國(guó)外來(lái)入侵植物的實(shí)時(shí)調(diào)查監(jiān)測(cè)和早期預(yù)警防控與研判應(yīng)對(duì)具有極為重要的防控決策指導(dǎo)價(jià)值。

獼猴桃Actinidia chinensis Planch因含有多種微量元素、氨基酸及豐富的維生素和礦物質(zhì)，被譽(yù)為“水果之王”。獼猴桃原產(chǎn)于中國(guó)，20世紀(jì)40年代，經(jīng)新西蘭培育后廣泛種植，現(xiàn)已成為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。隨著國(guó)內(nèi)獼猴桃栽培面積的不斷擴(kuò)大，灰霉病在四川、陜西和湖北等全國(guó)各地的獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，獼猴桃灰霉病的危害也日益突出，成為獼猴桃的主要病害之一。灰霉病菌Botrytiscinerea在獼猴桃生長(zhǎng)期侵染葉片、花萼和果實(shí)，造成落葉、花腐和果腐癥狀，在貯藏期造成果實(shí)軟腐，嚴(yán)重威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于獼猴桃灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主，用于生產(chǎn)上防治灰霉病的藥劑主要有苯胺基嘧啶類(lèi)、苯吡咯類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)和酰胺類(lèi)化學(xué)殺菌劑。由于灰霉病菌具有繁殖迅速、遺傳變異快和適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，這些殺菌劑的連續(xù)使用使其極易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致灰霉病菌對(duì)很多不同類(lèi)型殺菌劑產(chǎn)生不同程度的抗性。據(jù)報(bào)道，湖南、福建、江蘇和山東等多個(gè)地區(qū)的葡萄、草莓、番茄、黃瓜等果蔬植物上的灰霉病菌已經(jīng)對(duì)嘧霉胺、腐霉利兩種傳統(tǒng)化學(xué)藥劑產(chǎn)生較高的抗藥性;在日本大阪番茄上、我國(guó)江蘇草莓上的灰霉菌對(duì)異菌脲抗性頻率分別高達(dá)86.4%、64.6%;苯吡咯類(lèi)殺菌劑咯菌腈作為一種新型殺菌劑具有較好的田間防控效果，2019年山東蓬萊葡萄灰霉菌對(duì)咯菌腈抗性頻率僅為9.47。前人對(duì)以上幾種殺菌劑進(jìn)行抗藥性檢測(cè)的結(jié)果表明，不同寄主植物、不同生態(tài)區(qū)的灰霉病菌的抗性頻率不盡相同。

近年來(lái)關(guān)于灰霉病菌抗藥性的報(bào)道多見(jiàn)于葡萄、番茄、草莓等寄主植物，針對(duì)獼猴桃灰霉病抗藥性的研究鮮有報(bào)道，在實(shí)際生產(chǎn)中用于獼猴桃灰霉病菌防控的藥劑種類(lèi)和施藥頻次亦未見(jiàn)報(bào)道，四川獼猴桃灰霉病菌對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲等幾種常見(jiàn)殺菌劑的抗藥性尚不明確。本試驗(yàn)基于田間防控灰霉病用藥的實(shí)際情況，廣泛采集四川主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)灰霉病樣本，并采用MIC法測(cè)定獼猴桃灰霉菌對(duì)4種殺菌劑的抗藥性，旨在探明獼猴桃灰霉病菌對(duì)常見(jiàn)殺菌劑的抗性頻率、敏感類(lèi)型及多重抗藥性，為獼猴桃灰霉病藥劑的選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試藥劑

97%嘧霉胺原藥、98%咯菌腈原藥、98%腐霉利原藥、96%異菌脲原藥均由四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司提供。

1.2四川省獼猴桃灰霉病田間用藥情況調(diào)查

2016年3月至2018年11月，在四川都江堰、彭州、雙流、蒲江、雅安、綿竹、蒼溪和安州等獼猴桃種植區(qū)隨機(jī)選擇125個(gè)發(fā)生灰霉病的果園，調(diào)查并記錄種植戶在栽培管理過(guò)程中為防控獼猴桃灰霉病施用的藥劑名稱(chēng)及次數(shù)，統(tǒng)計(jì)主要藥劑種類(lèi)和施用的頻次。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，結(jié)合其他寄主灰霉病的抗藥性檢測(cè)情況，最終篩選出用于四川獼猴桃灰霉病菌的抗藥性檢測(cè)的藥劑。

1.3菌株的采集與分離

2016年—2018年，從四川都江堰、彭州、雙流、蒲江、雅安、綿竹、蒼溪和安州等8個(gè)獼猴桃主要種植區(qū)采集獼猴桃病葉、病花和病果，癥狀如圖1所示。將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室18～20℃濕潤(rùn)培養(yǎng)2d后，將具有灰霉病特征的病組織放置于解剖鏡下，采用龔國(guó)淑等的單孢分離法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再利用形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，共獲得灰葡萄孢菌122株（表1），于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4含藥培養(yǎng)基的制作

嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的鑒別濃度分別為1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取各種原藥0.1 g，然后用丙酮溶解后加入少量吐溫-80乳化，配制成濃度為1000μg/mL的母液，再用滅菌水將嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的母液稀釋為鑒別濃度的10倍，分別為10、1、10、50μg/mL。在無(wú)菌環(huán)境下，分別將稀釋后的4種藥劑溶液與滅菌后冷卻到60℃的PDA培養(yǎng)基按1：9比例混合充分搖勻，配成最終濃度為1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/ml_的含藥培養(yǎng)基，倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌水代替藥劑作為對(duì)照，用于抗藥性測(cè)定。

1.5獼猴桃灰霉病菌對(duì)4種殺菌劑抗藥性頻率的測(cè)定

采用最低抑制濃度法（MIC法）檢測(cè)獼猴桃灰霉病菌對(duì)不同殺菌劑的抗藥性頻率。將菌種在PDA培養(yǎng)基上20℃下活化3d后，再轉(zhuǎn)至d=90 mmPDA平板上培養(yǎng)3d。用5mm滅菌打孔器打取菌落邊緣生長(zhǎng)一致的菌餅若干，接種于含藥的PDA平板中央，每皿放置一塊，每處理3個(gè)重復(fù)，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)3d，敏感菌株的界定為不能或幾乎不能在鑒別濃度下正常生長(zhǎng)，抗性菌株為能在該濃度下正常生長(zhǎng)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)各個(gè)區(qū)域的抗性菌株發(fā)生頻率和抗性類(lèi)型。

抗性頻率=抗性菌株數(shù)/所測(cè)菌株總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1四川獼猴桃灰霉病防控的藥劑種類(lèi)及施用情況

對(duì)四川125個(gè)獼猴桃果園用藥情況的調(diào)查及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，種植戶針對(duì)獼猴桃灰霉病防控所施用的藥劑（主要成分）主要有嘧霉胺、異菌脲、腐霉利、啶酰菌胺、嘧菌環(huán)胺、多菌靈、甲基硫菌靈和咯菌腈等8種（表2）。2016年上述8種藥劑的施藥次數(shù)分別為165、86、87、23、16、26、15次和13次，累計(jì)施藥431次，平均每個(gè)果園施藥3.45次;2017年施藥次數(shù)分別為145、96、74、36、18、22、17次和12次，累計(jì)施藥420次，平均每個(gè)果園施藥3. 36次;2018年施藥次數(shù)分別為141、128、72、54、25、17、15次和15次，累計(jì)施藥467次，平均每個(gè)果園施藥3. 74次。嘧霉胺、異菌脲和腐霉利連續(xù)3年被高頻施用，但啶酰菌胺、嘧菌環(huán)胺、多菌靈、甲基硫菌靈和咯菌腈施用頻次相對(duì)較低。其中嘧霉胺施用頻次最高，2016年2018年3年中分別占總施用次數(shù)的38. 28%，34.52%和30.19%，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。同樣，腐霉利和多菌靈等傳統(tǒng)殺菌劑施用頻次均有不同程度下降;相反，異菌脲和啶酰菌胺施用頻次逐年增加，逐漸成為四川獼猴桃灰霉病防控的主要?dú)⒕鷦?嘧菌環(huán)胺、甲基硫菌靈和咯菌腈等施用頻次無(wú)明顯變化，僅在個(gè)別果園施用。根據(jù)以上結(jié)果可知，嘧霉胺、異菌脲和腐霉利這3種藥劑被大部分種植戶用于獼猴桃灰霉病的防控，故獼猴桃灰霉病菌對(duì)這3種藥劑的抗藥性情況亟須探明，另根據(jù)鄭媛萍等、紀(jì)明山等、李若晨等研究發(fā)現(xiàn)咯菌腈對(duì)其他寄主灰霉病菌防控效果較好，最終選擇嘧霉胺、異菌脲、腐霉利和咯菌腈4種藥劑用于抗藥性檢測(cè)，以進(jìn)一步探究四川獼猴桃灰霉病菌對(duì)這4種藥劑的抗藥性狀況。

2.2獼猴桃灰霉病菌的抗性頻率和分布

由表3可知，四川8個(gè)獼猴桃種植區(qū)的122個(gè)灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株群體對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的抗性頻率分別為95. 08%、86. 07%、80. 33%和5.74%。其中對(duì)嘧霉胺敏感菌株有6株，抗性菌株有116株;對(duì)咯菌腈敏感菌株有17株，抗性菌株有105株;對(duì)腐霉利敏感菌株有24株，抗性菌株有98株;對(duì)異菌脲敏感菌株有115株，抗性菌株有7株。表明四川省獼猴桃灰霉病菌群體對(duì)嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利3種藥劑已產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗藥性，且抗性頻率都在80%以上，以嘧霉胺最高;試驗(yàn)菌株對(duì)異菌脲的抗性頻率最低。針對(duì)同一藥劑，不同種植區(qū)的菌株抗性頻率不同，蒲江與雅安菌株對(duì)咯菌腈的抗性頻率均為100%，但綿竹與彭州菌株的抗性頻率分別是69. 23%和70. 00%;都江堰與安州菌株對(duì)腐霉利的抗性頻率均達(dá)到90%以上，而雅安菌株的抗性頻率只有66. 67%;蒲江、雅安與蒼溪3個(gè)區(qū)域未檢測(cè)到對(duì)異菌脲表現(xiàn)抗性的菌株。綜上表明，四川獼猴桃灰霉病菌已對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利產(chǎn)生了較高的抗藥性，對(duì)異菌脲產(chǎn)生了較低的抗藥性，迫切需要篩選新的殺菌劑防治獼猴桃灰霉病。

2.3獼猴桃灰霉病菌敏感性類(lèi)型

根據(jù)對(duì)不同殺菌劑抗感性的不同，將122個(gè)菌株分為8種敏感性類(lèi)型（表4），各類(lèi)型分別占總菌株數(shù)的65. 57%、10. 65%、7.38%、5.74%、5.74%、2.46%、1.64%、0. 82%。其中Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S類(lèi)型（對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表現(xiàn)抗性，對(duì)異菌脲表現(xiàn)敏感）（圖2）的菌株有80株，占全部菌株的65. 57%，表明大部分菌株對(duì)嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利產(chǎn)生抗性，而對(duì)異菌脲敏感。在122個(gè)灰葡萄孢菌株中，單抗菌株共12株，占總菌株數(shù)的9. 84%;雙抗菌株共23株，占總菌株數(shù)的18. 85%;三抗菌株共80株，占總菌株的65. 57%;對(duì)4種殺菌劑均產(chǎn)生抗性的菌株7株，占總菌株數(shù)的5.74%。說(shuō)明四川省不同種植區(qū)的獼猴桃灰霉病菌抗藥性以三抗類(lèi)型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S為主，在防治獼猴桃灰霉病時(shí)，連續(xù)多次施用嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利，導(dǎo)致獼猴桃灰霉病菌對(duì)這3種藥劑產(chǎn)生了抗藥性。異菌脲可以起到一定的防治效果。

3結(jié)論與討論

灰霉病菌具有繁殖快，遺傳變異快，適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，連續(xù)施用同一種化學(xué)藥劑容易產(chǎn)生抗藥性。本文結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中施用藥劑的種類(lèi)和頻次，對(duì)四川獼猴桃灰霉病菌進(jìn)行了抗藥性檢測(cè)，研究結(jié)果表明，來(lái)自四川獼猴桃的灰葡萄孢群體對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲等4種常用殺菌劑已產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。其中嘧霉胺、腐霉利和異菌脲是防控灰霉病的傳統(tǒng)藥劑，已有多個(gè)省份報(bào)道在其他作物上產(chǎn)生了抗藥性，且抗性頻率較高。這3種藥劑也是四川獼猴桃灰霉病防控中施用頻率最高的藥劑，其中對(duì)嘧霉胺和腐霉利已產(chǎn)生較高的抗藥性。異菌脲與腐霉利同屬于二甲酰亞胺類(lèi)殺菌劑，具有多作用位點(diǎn)，作用機(jī)理相似，且常常存在交互抗性，本試驗(yàn)中獼猴桃灰霉病菌對(duì)異菌脲的抗性頻率（5.74%）遠(yuǎn)低于腐霉利（80.33%），究其原因主要是腐霉利應(yīng)用到獼猴桃灰霉病防治的時(shí)間更早，長(zhǎng)期地施用導(dǎo)致灰霉病菌對(duì)其抗藥性更強(qiáng)。根據(jù)田間調(diào)查，咯菌腈僅偶爾用于防治獼猴桃灰霉病，但本研究顯示已產(chǎn)生了較高的抗藥性，關(guān)于灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗藥性鮮有報(bào)道，其抗藥性的產(chǎn)生是否與防治獼猴桃其他病害有關(guān)還有待調(diào)查。

灰葡萄孢對(duì)殺菌劑具有豐富的敏感性類(lèi)型可能與用藥歷史，用藥水平、施藥方法、氣候特征、栽培條件等密切相關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)四川獼猴桃灰霉病菌對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利、異菌脲共有8種敏感性類(lèi)型，以三抗類(lèi)型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S（對(duì)嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表現(xiàn)抗性，對(duì)異菌脲表現(xiàn)敏感）類(lèi)型為主（占65.57%），在8個(gè)獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利等3種殺菌劑對(duì)獼猴桃灰霉病的防治效果已不佳，且不宜混用。這一結(jié)果與喬廣行、劉圣明、張亞和鄭媛萍等人在番茄、草莓、葡萄等上的檢測(cè)結(jié)果相似，灰霉菌群體具有豐富的敏感性類(lèi)型，且以抗多種殺菌劑的敏感性類(lèi)型為主。但在四川獼猴桃灰霉病菌群體中發(fā)現(xiàn)的敏感性類(lèi)型比其他作物更加豐富，可能由于四川潮濕多雨，灰霉病易暴發(fā)，加上獼猴桃產(chǎn)值高，果農(nóng)為了快速控制病情，常常多種殺菌劑同時(shí)施用和頻繁施用，且隨意提高施用濃度，勢(shì)必導(dǎo)致多重抗藥性的產(chǎn)生。應(yīng)注意藥劑的交替使用，并進(jìn)一步監(jiān)測(cè)獼猴桃灰霉病的周年流行動(dòng)態(tài)，提前做好預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，避免盲目用藥。

本文在明確四川獼猴桃灰霉病菌對(duì)常用殺菌劑的抗藥性的前提下，建議在獼猴桃產(chǎn)區(qū)限制使用嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利等3種殺菌劑，而異菌脲應(yīng)與其他殺菌劑輪換使用，避免長(zhǎng)期、大量地在同一產(chǎn)區(qū)使用。同時(shí)，還需進(jìn)一步對(duì)更多殺菌劑進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，掌握灰霉病菌對(duì)不同殺菌劑抗性變化趨勢(shì)，篩選并應(yīng)用高效防控藥劑。另外，還需建立完善的病害預(yù)測(cè)預(yù)警體系，合理搭配獼猴桃抗病品種，建造避雨設(shè)施及其配套措施，從而達(dá)到對(duì)獼猴桃灰霉病的綠色綜合防控。