劉露 林志堅(jiān) 周挺等
中圖分類號(hào):S 476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.16688/j.zwbh 2020162
作物青枯病是一類典型的土傳細(xì)菌性維管束病害,易發(fā)生,難防治。20世紀(jì)初,TWwort和dHerelle發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了噬菌體(bacteriophage,phage),其廣泛存在于自然界中。由于其具有寄生專一性、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn),被冠以細(xì)菌的天然“殺手”而備受關(guān)注,具有巨大的應(yīng)用潛力。噬菌體是嚴(yán)格的專性活體寄生物,無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),具有株系間差異大等特點(diǎn),導(dǎo)致在保存上必須采用不同的方法。Ackermann等報(bào)道,芽胞桿菌噬菌體AP50在-80℃下僅能存活6個(gè)月,而腸桿菌噬菌體PRD1保存12年效價(jià)僅降低3個(gè)數(shù)量級(jí);王紹花2010年報(bào)道德氏乳桿菌噬菌體phiLdb在4℃下可保存6個(gè)月,于美玲2015年報(bào)道乳桿菌烈性噬菌體Lpla保存效果最好的溫度是-80℃。高苗發(fā)現(xiàn),青枯菌噬菌體∈RS-1原液于4℃下保存6個(gè)月后尚存較高的活性。因此,要開發(fā)利用噬菌體,首要的問題就是噬菌體的長期保存。由于不同的噬菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)各異,對(duì)不同條件的響應(yīng)能力不同,以何種形式或方法保存,目前尚無明確定論。本研究以福建不同煙區(qū)分離的4株青枯菌噬菌體為對(duì)象,研究不同保存條件下噬菌體的活性變化,尋找適合噬菌體長期保存的方法。
1.1供試菌株
青枯病菌Ral3tonia pseudosolanacearum Z5;青枯病菌短尾噬菌體Pl,P2,P3和P4均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定保存。
1.2青枯病菌培養(yǎng)
將保存于-75℃的青枯病菌Z5活化后挑取單菌落于裝有100 mL NB培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L、牛肉浸膏3 g/L、葡萄糖2.5 g/L,pH 7.2)的三角燒瓶中,28℃,180r/min振蕩培養(yǎng)至濃度約1×108cfu/mL,備用。
1.3噬菌體培養(yǎng)
按1%( V/V)的接種量將噬菌體原液接種于1.2培養(yǎng)的青枯病菌懸浮液中,搖勻,靜置15 min,28℃,130r/min振蕩培養(yǎng)12~16h,獲得噬菌體培養(yǎng)液,12000r/min離心5 min后經(jīng)0.45μm濾膜抽真空過濾除菌,上清液為噬菌體原液,效價(jià)為2×1010PFU/mL,備用。
1.4噬菌體保存方法
設(shè)4個(gè)處理,處理1:噬菌體原液;處理2:噬菌體原液:青枯菌液=1:1(V/V,下同);處理3:噬菌體原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2(1mL噬菌體原液和1mL青枯菌液以及2mL 40%甘油的混合液);處理4:噬菌體原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2(1mL噬菌體原液和1mL青枯菌液以及2mL80%甘油的混合液)。分別置于-75、-25、4℃和室溫保存,90、180、270 d和365 d分別取樣,測定噬菌體的效價(jià)。
1.5噬菌體的效價(jià)測定
噬菌體效價(jià)(plaque-forming unit,PFU):是指每毫升樣品中所含有的具有侵染性的噬菌體粒子數(shù),采用雙層平板法測定,具體測定方法參照高苗的方法。
噬菌體效價(jià)(PFU/mL)=平均噬菌斑數(shù)×2×稀釋倍數(shù)。
4種不同處理的噬菌體分別在-75、-25、4℃、室溫下保存的結(jié)果見表1~表4。結(jié)果表明,-75℃和-25℃下保存(表1、表2),4種處理的保存效果都較好,365d后效價(jià)下降0~3個(gè)數(shù)量級(jí),其中噬菌體P4株系的保存效果最好,其次為噬菌體P1和P2株系,噬菌體P3株系較差,如保存365 d后噬菌體P4株系效價(jià)只下降0~1個(gè)數(shù)量級(jí),噬菌體P3株系效價(jià)卻下降1~3個(gè)數(shù)量級(jí);4℃下保存(表3),噬菌體原液處理和噬菌體原液:青枯菌液=1:1處理的保存效果最好,365 d后效價(jià)下降1~5個(gè)數(shù)量級(jí),其中噬菌體P4株系效價(jià)只下降1個(gè)數(shù)量級(jí),噬菌體原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2處理的保存效果次之,365 d后效價(jià)下降5~7個(gè)數(shù)量級(jí),噬菌體原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2處理的保存效果最差,90 d后效價(jià)下降6~7個(gè)數(shù)量級(jí);室溫保存的效果總體較差(表4),但其中噬菌體原液:青枯菌液=1:1處理的保存效果相對(duì)較好,180 d后效價(jià)下降1~2個(gè)數(shù)量級(jí),270 d后效價(jià)下降6~7個(gè)數(shù)量級(jí);其次為噬菌體原液處理,噬菌體Pl和P2株系保存90 d后全部失活,而噬菌體P3和P4株系保存180 d后,其效價(jià)下降6個(gè)數(shù)量級(jí);噬菌體原液:青枯菌液:40%甘油或80%甘油=1:1:2處理的保存90 d后,噬菌體P1、P3和P4株系全部失活,但噬菌體P2株系采用噬菌體原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2處理,保存365 d仍有較高的活性,效價(jià)僅僅下降3個(gè)數(shù)量級(jí)。
噬菌體的保存方法已有報(bào)道,主要集中在對(duì)動(dòng)物病原細(xì)菌噬菌體的保存,常見的有噬菌體原液或噬菌體原液加入甘油、DMSO等保護(hù)劑,于室溫、4℃、凍干、-75'C或液氮保存,但噬菌體不同,效果也不同。如李隴平等報(bào)道金黃色葡萄球菌烈性噬菌體加入7% DMSO,-80℃冷藏3個(gè)月,效價(jià)與初始效價(jià)保持同一個(gè)指數(shù)級(jí);黎爾納等報(bào)道3株木糖氧化無色桿菌噬菌體原液加入甘油或DMSO后,于-80℃、-20℃和4℃保存16個(gè)月后,其中2株的效價(jià)能穩(wěn)定在初始狀態(tài),1株的效價(jià)降低1個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似,供試的4株噬菌體同法同溫保存,但效果不同,如采用噬菌體原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2方法-75℃保存365 d,噬菌體P3株系的效價(jià)下降2個(gè)數(shù)量級(jí),而噬菌體P1、P2和P4株系的效價(jià)穩(wěn)定在初始狀態(tài);采用噬菌體原液室溫保存,90 d后噬菌體Pl和P2株系全部失活,270 d后噬菌體P3株系全部失活,而噬菌體P4株系仍有活性。
Golec等報(bào)道,-80℃下有尾噬菌體儲(chǔ)存于宿主體內(nèi),不會(huì)影響噬菌體和宿主的生存能力;高苗報(bào)道噬菌體原液+20%甘油室溫和4℃保存6個(gè)月后均檢測不到噬菌斑。本研究結(jié)果顯示,室溫和4℃下添加宿主可提升保存效果,添加甘油反而不利;低溫下(-75℃和-25℃)添加宿主對(duì)噬菌體的保存效果影響不大,但添加甘油可提升保存效果。室溫下,噬菌體原液:青枯菌液=1:1保存180 d,效價(jià)下降1~2個(gè)數(shù)量級(jí),而噬菌體原液保存的效價(jià)下降了6個(gè)數(shù)量級(jí)或全部失活;另外,添加甘油處理的噬菌體90 d后全部失活(噬菌體P2株系除外);-75℃和-25℃下,添加甘油處理的保存365d,噬菌體效價(jià)降幅最大的僅2個(gè)數(shù)量級(jí)。由于噬菌體是一種寄生于活體細(xì)胞內(nèi)的非細(xì)胞生物,一旦離開寄主就不能獨(dú)立新陳代謝,但低溫可降低其新陳代謝,保持活性,因此低溫可提高噬菌體的保存效果;室溫下,由于噬菌體的代謝活動(dòng)正常,需要充足的宿主,因此添加宿主有利于噬菌體保持活性,若添加甘油,宿主受甘油保護(hù),噬菌體的侵染幾率下降或完全不能侵入,導(dǎo)致效價(jià)下降。
綜上所述,噬菌體原液:青枯菌液=1:1處理在4種溫度下保存都能保持較高的活性,尤其是室溫保存180 d后,噬菌體效價(jià)僅下降1~2個(gè)數(shù)量級(jí),保存270 d后噬菌體仍有較高的活性。該方法不需要添加保護(hù)劑,不受試驗(yàn)條件限制,可為今后噬菌體制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考依據(jù),是青枯菌噬菌體最簡單易行的保存方法。另外,無論何種處理,-75℃和-25℃的保存效果都表現(xiàn)最好,可長期保存噬菌體。