候吉超　李忠鵬　梁雨欣等

中圖分類號：S 565.1.Q 943.2 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020133

草甘膦（glyphosate）又稱鎮(zhèn)草寧，1971年由美國貝爾德等發(fā)現(xiàn)，并由孟山都公司開發(fā)生產(chǎn)，目前已成為全球銷量最大的除草劑品種。來自土壤農(nóng)桿菌CP4的epsps基因所編碼的CP4-EPSPS蛋白由于對草甘膦具有高抗性而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物。目前，我國已獲得多個轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因農(nóng)作物，包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等。中國是大豆原產(chǎn)國，同時也是大豆需求大國，每年我國從美國、巴西、阿根廷等國進口大量轉(zhuǎn)基因大豆，年進口總量由1996年的57萬t上升到2019年的8851萬t，進口量不斷攀升。隨著轉(zhuǎn)基因大豆大量進口及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，轉(zhuǎn)基因大豆的安全問題逐漸引起人們的關(guān)注。因此，建立轉(zhuǎn)基因大豆新型快速檢測技術(shù)顯得尤為重要。

目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測主要分為核酸檢測和蛋白質(zhì)檢測兩大類。核酸檢測以PCR檢測技術(shù)為主，此外還相繼建立了巢式PCR、熒光定量PCR和Southern-blot等檢測技術(shù)。PCR檢測技術(shù)具有特異性強、靈敏度高等特點。蛋白檢測主要為血清學(xué)檢測技術(shù)，包括ELISA、雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）和斑點ELISA（Dot-ELISA）等檢測技術(shù)。血清學(xué)檢測技術(shù)具有重復(fù)性好、操作簡便等特點，對檢測環(huán)境、儀器要求較低，適合在基層推廣應(yīng)用。在血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，研究者進一步研制出了膠體金試紙條檢測技術(shù)，但是對轉(zhuǎn)基因加工制品靈敏度較低。

本研究以CP4-EPSPS單克隆抗體和多克隆抗體為基礎(chǔ)，成功建立檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA方法，將檢測時間由普通DAS-ELISA的150 min縮短至75 mln。通過對檢測條件的優(yōu)化，提高該檢測方法的準確性、簡便性，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆的快速檢測。

1材料與方法

1.1材料與試劑

CP4-EPSPS標準蛋白、CP4-EPSPS特異性單克隆抗體1D12、羊多克隆抗體8092由本實驗室制備;非轉(zhuǎn)基因‘Williams和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆‘W-82系列由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供;辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗CP4EPSPS多克隆抗體8092由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司提供;雙組分TMB顯色液購于北京索萊寶科技有限公司;脫脂奶粉購于生工生物工程（上海）股份有限公司;HRP標記兔抗小鼠IgG購于Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

BioTek洗板機、BioTek酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司;高速冷凍臺式離心機購于日本日立公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器購于上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1快速DAS-ELISA方法的建立

以CP4-EPSPS單克隆抗體1D12為捕獲抗體包被96孔酶標板100μL/孔，40C靜置過夜，加入5%脫脂奶粉250μL/孔，37℃封閉1h;樣品用PBS緩沖液適當稀釋后，充分研磨、離心、取上清液，將上清液與檢測抗體HRP標記的多克隆抗體8092先后加入96孔酶標板，各50μL/孔，37℃靜置孵育1h，以上每一步結(jié)束后96孔酶標板用PBST洗3遍，拍干;加TMB顯色液90μL/孔，避光顯色5～15 min，加入2 mol/L H₂SO₂溶液45μL/孔終止反應(yīng)。以檢測樣品OD₁₅₀（P值）/陰性對照OD₁₅₀（N值）≥2.1判定為陽性檢測結(jié)果。

試驗重復(fù)3次，同時設(shè)置陽性（轉(zhuǎn)Cp4 ep3-ps基因大豆葉片）、陰性（非轉(zhuǎn)基因大豆葉片）、空白（去離子水）3個對照。

1.3.2快速DAS-ELISA方法的優(yōu)化

以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 ep3-ps基因大豆葉片作為陰性對照和陽性對照，運用建立的快速DAS-ELISA方法進行檢測。采用矩陣滴定法優(yōu)化捕獲抗體和檢測抗體的工作濃度，以P/N最大值確定抗體工作濃度。運用DAS-ELISA方法分別對捕獲抗體孵育時間、待測樣品與檢測抗體共同孵育時間進行優(yōu)化，以P/N最大值確定捕獲抗體孵育時間，同時分析P/N值，選擇合適的樣品與檢測抗體共同孵育時。

1.3.3快速DAS-ELISA方法檢測范圍的確定

用PBS將CP4-EPSPS蛋白標準品濃度從160μg/mL等比稀釋至0.078 125μg/mL，運用優(yōu)化后的快速DAS-ELISA方法進行檢測，每個濃度3個技術(shù)重復(fù)，以蛋白濃度為橫坐標，P/N值為縱坐標，繪制靈敏度曲線，得出快速DAS-ELISA方法的檢測范圍。

1.3.4檢測材料的優(yōu)化

根據(jù)1.3.3小節(jié)的試驗結(jié)果對大豆葉片和籽粒進行稀釋度優(yōu)化，采集非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒，葉片用PBS緩沖液（1g樣品：10 mL PBS）充分研磨后，用PBS緩沖液等比稀釋至1：20 000倍;籽粒處理方法同葉片，最終等比稀釋至1：640倍;12 000r/min離心5min，取上清液，運用建立的快速DAS-ELISA方法對其進行檢測，根據(jù)P/N值，得出葉片和籽粒檢測時的稀釋區(qū)間。

1.3.5重復(fù)性試驗

運用建立的快速DAS-ELISA方法檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps大豆葉片和種子各4份，每份材料3個技術(shù)重復(fù)，測定OD₁₅₀，分別計算板內(nèi)、板間變異系數(shù)。

1.3.6田間樣品檢測

試驗田中隨機采集100份大豆植株葉片，用PBS緩沖液從1：10至1：320倍之間隨機稀釋，充分研磨，12 000r/min離心5 min，取上清液，運用上述建立的快速DAS-ELISA方法對其檢測，同時利用Western blot方法檢測，以單抗1D12為一抗（1：5000稀釋），HRP標記的兔抗小鼠IgG為二抗（1：10000稀釋），對比二者檢測結(jié)果，并運用建立的檢測方法對5粒非轉(zhuǎn)基因和15粒轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆籽粒進行檢測，驗證檢測方法效果。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗均進行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0進行顯著性分析和Graphpad Prism 8.0軟件進行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 CP4-EPSPS蛋白快速DAS-ELISA檢測方法的建立

采用矩陣滴定法篩選捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度（表1），當捕獲抗體工作濃度為10 μg/mL，檢測抗體工作濃度為1. 25μg/mL時，P/N值最大，表明在此濃度下檢測效果最好，確定其為抗體最佳工作濃度。分別對捕獲抗體、待測樣品與檢測抗體共同孵育時間進行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示，捕獲抗體最佳包被條件為37℃2h后4℃過夜;據(jù)圖2所示，當待測樣品與檢測抗體37℃共同孵育75min時，P/N值最大，但37℃孵育60 min和75 min時P/N值無顯著差異，本研究建立的檢測方法以快速定性為主，綜合考慮，確定樣品與檢測抗體最佳共同孵育條件為37℃孵育60 min。

1）P/N為檢測樣品OD₁₅₀/陰性對照OD₁₅₀。 P/N is the ratio of OD₁₅₀between sample and blank control.

2.2快速DAS-ELISA檢測范圍的確定

運用建立的快速DAS-ELISA方法對不同濃度CP4-EPSPS蛋白標準品溶液進行檢測，建立CP4EPSPS蛋白靈敏度曲線，如圖3所示，當CP4-EPSPS蛋白濃度在0.3125～80μg/mL時，檢測結(jié)果為陽性，即該方法的檢測范圍。

2.3檢測材料的優(yōu)化

對轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片、籽粒蛋白粗提液濃度進行優(yōu)化，如表2所示，當轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片樣品稀釋10～5000倍時，檢測結(jié)果呈陽性，且稀釋80倍時P/N值最大，因此，確定葉片樣品稀釋區(qū)間為10～80倍;如表3所示，籽粒樣品稀釋10～320倍時，檢測結(jié)果呈陽性，為了便于操作，確定籽粒樣品稀釋區(qū)間為10～80倍。在該稀釋范圍內(nèi)，檢測效果較好，有利于快速定性檢測轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆。

2.4重復(fù)性試驗

運用建立的快速DAS-ELISA方法對8份樣品進行檢測，結(jié)果如表4所示，8份樣品板內(nèi)變異系數(shù)為1. 64%～5. 42%，板間變異系數(shù)為3.05%～9.13%，變異系數(shù)均小于25%，表明建立的檢測方法穩(wěn)定性較好，符合ELISA定性試劑盒參考標準。

2.5田間樣品檢測緒果比較

Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，100份檢測樣品中共計有53份樣品出現(xiàn)特異性免疫印跡，快速DAS-ELISA方法檢測結(jié)果顯示（表5），共計檢測出53份陽性樣品，對比兩種方法檢測結(jié)果，兩種檢測方法符合率為100%，對20份已知的大豆籽粒進行檢測（W代表非轉(zhuǎn)基因大豆，C代表轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆），非轉(zhuǎn)基因大豆P/N值<2.1，轉(zhuǎn)基因大豆P/N值≥2.1，與標準結(jié)果比較檢測符合率為100%（表6）。

3討論

本研究以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒作為試驗材料對快速DAS-ELISA工作條件進行優(yōu)化，與使用重組蛋白作為試驗材料相比，結(jié)果更真實可靠。蛋白免疫印跡雜交（West-ern-blot）是鑒定轉(zhuǎn)基因生物的標準方法，本研究以Western-blot檢測結(jié)果作為標準衡量快速DAS-ELISA的準確性。對100份大豆樣品的檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，本研究建立的快速DAS-ELISA準確率為100%。

為了縮短檢測時間，本研究優(yōu)化了檢測方法。首先，檢測抗體經(jīng)HRP標記，省去了酶標二抗的反應(yīng)步驟：此外，將抗原孵育和檢測抗體孵育這兩步反應(yīng)合并為一步進行，進一步減少了檢測步驟。檢測過程僅需要兩步，將檢測時間縮短至75 min，目前，國外進口試劑盒檢測時間在2. 5～3.5 h之間。本檢測方法中，樣品孵育超過30 min時，檢測結(jié)果即呈陽性，因此在實際檢測中，孵育30 min可以作為樣品與抗體反應(yīng)最短時間。

在測定DAS-ELISA的檢測范圍時發(fā)現(xiàn)，隨著CP4-EPSPS蛋白濃度等比例逐漸降低，P/N值呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，出現(xiàn)這種情況，是因為當?shù)鞍走^飽和時，部分蛋白沒有結(jié)合檢測抗體而與捕獲抗體直接結(jié)合，最終影響P/N值。

綜上所述，本研究建立的快速DAS-ELISA方法適用于轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆植株和種子的快速檢測，為轉(zhuǎn)基因后代材料的精準鑒定和轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的監(jiān)管提供技術(shù)手段，該檢測方法是否適用于玉米、水稻等作物還有待于進一步研究。