張乃元　張蕾　程云霞等

中圖分類(lèi)號(hào)：S 433.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020225

外界微生物時(shí)刻威脅著昆蟲(chóng)的存活，因此免疫系統(tǒng)在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要。先天免疫系統(tǒng)是昆蟲(chóng)的主要免疫系統(tǒng)，主要由細(xì)胞免疫和體液免疫組成。體液免疫中酚氧化酶（phenol oxi-dase，PO》和溶菌酶（lysozyme）是免疫關(guān)鍵酶，PO和溶菌酶活性是免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)。昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)受內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，內(nèi)分泌激素在昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。昆蟲(chóng)體內(nèi)主要的內(nèi)分泌激素是保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（molting hormone，MH），它們?cè)诶ハx(chóng)的生長(zhǎng)過(guò)程中不僅可以聯(lián)合調(diào)控昆蟲(chóng)的變態(tài)、遷飛和繁殖，而且在昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)中也有非常重要的調(diào)控功能。JH是昆蟲(chóng)咽側(cè)體分泌的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠保持幼蟲(chóng)狀態(tài)、抑制蛻皮和變態(tài)，調(diào)控昆蟲(chóng)生命周期中每一個(gè)重要發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變，在昆蟲(chóng)發(fā)育的臨界期高濃度JH會(huì)阻礙變態(tài)提前發(fā)生。蛻皮激素的主要成分是20羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdys-one，20E），主要作用是激發(fā)昆蟲(chóng)的蛻皮活動(dòng)，調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)所有的幼蟲(chóng)態(tài)、蛹以及成蟲(chóng)的轉(zhuǎn)換。在針對(duì)黑腹果蠅Drosophila melanogaster的研究中發(fā)現(xiàn)，注射20E后，黑腹果蠅的細(xì)胞吞噬功能和PO活性得到了增強(qiáng)。棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera在注射20E后，細(xì)胞吞噬功能提高，細(xì)胞免疫明顯增強(qiáng)。JH和MH對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫既有正調(diào)控作用，也有負(fù)調(diào)控作用，并可通過(guò)增強(qiáng)或抑制PO活性來(lái)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)體液免疫。

黏蟲(chóng)是嚴(yán)重威脅我國(guó)主要糧食作物生產(chǎn)安全的重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。由于近年來(lái)黏蟲(chóng)在我國(guó)局部地區(qū)常常暴發(fā)，對(duì)糧食生產(chǎn)安全帶來(lái)重大威脅。暴發(fā)的黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)生黑化現(xiàn)象已成常態(tài)，其免疫能力顯著增強(qiáng)。但這種免疫能力是否受到內(nèi)分泌激素的影響還不清楚，關(guān)于黑化黏蟲(chóng)內(nèi)分泌激素MH如何調(diào)控免疫反應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在明確黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)被球孢白僵菌Beauveria bas-siana侵染后其內(nèi)分泌激素MH的含量變化。注射20E稀釋液后，明確被白僵菌侵染的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率的變化以及體液免疫中PO和溶菌酶活性的變化，揭示黑化黏蟲(chóng)體液免疫和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜害蟲(chóng)組提供。使用0. 01%吐溫80溶液配制10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷cfu/mL和10⁸cfu/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，經(jīng)SPSS-Probit回歸模型分析處理，球孢白僵菌對(duì)黑化黏蟲(chóng)的LC₅₀約為10⁶cfu/mL，本試驗(yàn)所有黏蟲(chóng)感染球孢白僵菌的濃度均為10⁶cfu/mL。

供試?yán)ハx(chóng)及飼養(yǎng)：供試黏蟲(chóng)采集于吉林省四平市公主嶺市田間。在飼養(yǎng)瓶（直徑9 cm×高13 cm）中高密度誘導(dǎo)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度為10頭/瓶。飼養(yǎng)方法參照郭棟、呂偉祥等室內(nèi)人工飼養(yǎng)方式，每日更換30～50cm高的玉米苗直至幼蟲(chóng)停止取食。飼養(yǎng)溫度設(shè)置為（23±1）℃，濕度設(shè)置為（70±5）%，光周期設(shè)置為L(zhǎng)∥D=14 h∥10h。

1.2球孢白僵菌和外源蛻皮激素注射方法

1.2.1黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)白僵菌注射方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，球孢白僵菌濃度10⁶cfu/mL注射后可以激活黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，且有近半數(shù)黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)可以完成世代發(fā)育。將蛻皮24h內(nèi)的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)置于冰上冷凍麻醉15 min，幼蟲(chóng)靜止后，使用微量注射器吸取10⁶cfu/ml_的球孢白僵菌孢子懸浮液1μL，注入幼蟲(chóng)第3與第4腹足之間的腹部。處理對(duì)照組注射0. 01%吐溫80溶液。每個(gè)處理組30頭蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。幼蟲(chóng)傷口閉合并且晾干后，放入裝有新鮮玉米幼苗的飼養(yǎng)瓶中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.2黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)20E稀釋液注射方法

取20 mg 20E加入1mL無(wú)水乙醇充分溶解混勻后，得到20μg/μL的20E母液。用無(wú)水乙醇對(duì)20μg/μL的20E母液2倍梯度稀釋?zhuān)玫綕舛葹?. 25、2.5、5、10μg/μL的20E稀釋液并進(jìn)行編號(hào)。蛻皮24h內(nèi)的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)注射球孢白僵菌孢子懸浮液后，立刻對(duì)其注射20E液。對(duì)照組為注射球孢白僵菌孢子懸浮液后立刻注射無(wú)水乙醇。每個(gè)處理組30頭蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。注射方法同1.2.1。

1.3免疫指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 MH含量測(cè)定方法

在注射球孢白僵菌后8、24、48、72h和96h分別取對(duì)照組（注射吐溫80）以及處理組（被白僵菌侵染）的黏蟲(chóng)血淋巴樣品，每次采集3頭黏蟲(chóng)，每頭幼蟲(chóng)采集血淋巴約50μL，每頭黏蟲(chóng)血淋巴樣品重復(fù)測(cè)試3次。使用昆蟲(chóng)蛻皮激素（MH）試劑盒測(cè)定MH含量。在96孔酶標(biāo)板中設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔中加入稀釋為10、20、40、80、160ng/L的MH標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔中加入待測(cè)樣品及樣品稀釋液后在預(yù)熱至37℃的水浴鍋中溫育30 min。溫育后棄去板中的液體，使用洗滌液洗板并拍干。加入酶標(biāo)試劑溫育30 min并使用洗滌液洗滌拍干。加入顯色試劑在37℃的水浴鍋避光顯色15 min。避光顯色后加入終止劑終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD），分別通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的MH含量。

1.3.2被球孢白僵菌侵染的黑化黏蟲(chóng)注射20E后幼蟲(chóng)死亡率測(cè)定

每天觀察記錄對(duì)照組（被白僵菌侵染后僅注射無(wú)水乙醇）的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)，以及處理組（被白僵菌侵染后）分別注射1. 25、2.5、5、10、20 μg/μL20E稀釋液的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)的存活情況，統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)死亡數(shù)量，直至幼蟲(chóng)化蛹。統(tǒng)計(jì)分析黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的校正死亡率。每個(gè)處理組30頭蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。選取對(duì)黑化黏蟲(chóng)死亡率影響最顯著的20E稀釋液進(jìn)行血淋巴免疫酶活性測(cè)定試驗(yàn)。

1.3.3血淋巴PO和溶菌酶活性的測(cè)定

處理組在注射球孢白僵菌孢子懸浮液后注射5μg/μL20E稀釋液。處理對(duì)照組在注射球孢白僵菌后注射無(wú)水乙醇。另設(shè)空白組不作處理以驗(yàn)證注射球孢白僵菌的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)被侵染成功。在被白僵菌侵染后8、24、48、72 h和96 h取黏蟲(chóng)血淋巴樣品，每次采集3頭黏蟲(chóng)，每頭采集約50μL，每頭黏蟲(chóng)血淋巴重復(fù)測(cè)試3次。使用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定溶菌酶和PO活性。試劑盒操作方法參照1.3.1。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分方差分析。用單因素方差分析（ANOVA）Tukeys HSD和獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1白僵菌侵染對(duì)黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)MH含量的影響

從圖1可以看出，黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的MH含量隨侵染后時(shí)間的增加呈先降低再升高的趨勢(shì)，總體上呈現(xiàn)侵染組高于對(duì)照組（侵染后24h除外）。對(duì)照組（注射吐溫-80） MH含量在處理后8～72 h呈下降趨勢(shì)。在處理后96 h時(shí)MH含量顯著升高（F_4，40=25. 131，P<0. 05），達(dá)到120. 00 ng/l_。與對(duì)照組相比，注射球孢白僵菌后，在侵染初期8h時(shí)黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的MH含量達(dá)到136. 96 ng/L，顯著高于對(duì)照組的95. 25 ng/L（t=-9.028，fg=16，P<0. 05），是對(duì)照組的1. 44倍。在侵染中期24 h時(shí)，MH含量低于對(duì)照組，僅為54. 54 ng/L。48h時(shí)MH含量高于對(duì)照但無(wú)顯著差異（t=-1.112，df=16，P>0. 05）。而在侵染后期72 h（t=-4.510，df=16，P<0. 05）、96h（t=-6.889，df=16，P<0. 05）時(shí)，黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的MH含量顯著增加，并且顯著高于對(duì)照組。在侵染后96h時(shí)達(dá)到最大值197. 79 ng/L，是對(duì)照組的1. 65倍。

2.2注射20E對(duì)被菌侵染的黑化黏蟲(chóng)死亡率的影響

由圖2可以看出，注射球孢白僵菌的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)在注射不同濃度20E后，其校正死亡率有不同程度的下降。注射1. 25、2.5μg/μL和20μg/μL的20E后黑化黏蟲(chóng)的校正死亡率有所降低，但與注射無(wú)水乙醇的對(duì)照組相比，差異不顯著（F_5，12=2.909，P>0.05）。注射5μg/μL和10μg/μL的20E后黑化黏蟲(chóng)的校正死亡率顯著降低（F_5，12=2.909，P<0. 05），分別為19. 28%和26. 51%。供試的5個(gè)濃度中，5μg/μL的20E處理后被侵染的黑化黏蟲(chóng)的死亡率顯著低于對(duì)照組（F_5，12=2.909，P<0.05）。這說(shuō)明注射20E有利于黏蟲(chóng)免疫能力增強(qiáng)。

2.3注射20E對(duì)被茵侵染的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)溶菌酶活性的影響

從圖3中可以看出，空白對(duì)照組（不作處理）溶菌酶活性較低，在不同時(shí)間其活性無(wú)顯著差異（F_4，40=0. 366，P>0. 05）。對(duì)照組（被球孢白僵菌侵染后僅注射無(wú)水乙醇）被球孢白僵菌侵染后，體液免疫激活，溶菌酶活性增加。被球孢白僵菌侵染后注射20E的處理組免疫反應(yīng)增強(qiáng)，溶菌酶活性高于對(duì)照組。注射20E的處理組的溶菌酶活性與對(duì)照組變化趨勢(shì)相同，在侵染后隨時(shí)間增加溶菌酶活性降低。對(duì)照組溶菌酶活性在被侵染后8h最高，達(dá)到最大值717. 61 U/mL，隨后溶菌酶活性開(kāi)始下降，隨侵染后時(shí)間的增加，溶菌酶活性逐漸趨于穩(wěn)定。經(jīng)20E誘導(dǎo)的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的溶菌酶活性在8h時(shí)最高，并顯著高于其他時(shí)間（F_4，40=97. 262，P<0. 05）。被白僵菌侵染后8h（F_2，24=386. 35，P<0. 05）和24 h（F_2，24=128. 323，P<0. 05）時(shí)20E處理組溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組，在侵染48h之后，注射20E的處理組的溶菌酶活性也逐漸回到空白組基線水平。

2.4注射20E對(duì)被菌侵染的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)PO活性的影響

從圖4中可以看出，空白組PO活性較低，在不同時(shí)間無(wú)顯著差異（F_4，40=2. 885，P>0. 05）。處理對(duì)照組在注射球孢白僵菌后，球孢白僵菌激活了黑化黏蟲(chóng)的體液免疫，其PO活性增加。24h時(shí)PO活性達(dá)到最大值132. 25 U/mL。隨被侵染時(shí)間的增加，其PO活性顯著降低（F_4，40-225. 340，P<0. 05）。注射球孢白僵菌后又注射20E的處理組，黑化黏蟲(chóng)經(jīng)20E誘導(dǎo)后免疫反應(yīng)增強(qiáng)，PO活性高于對(duì)照組。在侵染后8 h（F_2，24=250. 345，P<0. 05）、24 h（F_2，24=235. 849，P<0. 05）和48 h（F_2，24=121. 385，P<0. 05）20E處理組PO活性均顯著高于對(duì)照組，并在侵染后8h達(dá)到最大值156. 83 U/mL。

3討論

昆蟲(chóng)種類(lèi)繁多、形態(tài)各異，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，作為地球上數(shù)量最多、分布最廣的動(dòng)物群體，逐漸形成了獨(dú)特的免疫機(jī)制。神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)昆蟲(chóng)的免疫功能起到主要的調(diào)節(jié)作用。昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛻皮激素（MH）已被證明在發(fā)育、變態(tài)、生殖等方面具有重要作用，并且對(duì)昆蟲(chóng)的先天免疫反應(yīng)有重要調(diào)控作用。蛻皮激素的主要成分20羥基蛻皮酮（20E）可以激活細(xì)胞免疫和體液免疫來(lái)對(duì)抗外源入侵微生物，而外源微生物的刺激也會(huì)通過(guò)3脫氫蛻皮激素-3β-還原酶促進(jìn)20E滴度升高。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)注射球孢白僵菌來(lái)測(cè)定黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的MH含量，發(fā)現(xiàn)被侵染后的黑化黏蟲(chóng)體內(nèi)的MH含量出現(xiàn)顯著變化。MH含量在侵染后高于對(duì)照組，侵染后8、72 h和96 h尤為明顯。其原因是被球孢白僵菌侵染后，20E可以迅速激活免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗外源入侵微生物。這說(shuō)明MH在黑化黏蟲(chóng)體液免疫反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)體液免疫可以受20E調(diào)控，酚氧化酶（PO）和溶菌酶等保護(hù)昆蟲(chóng)免受傷害。酚氧化酶是昆蟲(chóng)體液免疫中非常重要的免疫因子。在昆蟲(chóng)表皮的硬化和黑化的過(guò)程中酚氧化酶具有重要作用。在昆蟲(chóng)受到外源病原物的刺激時(shí)酚氧化酶同樣具有重要作用。酚氧化酶活性是衡量昆蟲(chóng)體液免疫的重要指標(biāo)之一。黑腹果蠅注射MH后，其體內(nèi)的PO活性增強(qiáng)。針對(duì)埃及伊蚊Aedes aegypti的研究發(fā)現(xiàn)，鑒定到的一條PO基因序列中有2個(gè)可以結(jié)合20E受體復(fù)合物EcR/USP的順式作用元件，20E的刺激能上調(diào)PO的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)球孢白僵菌侵染后的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)注射20E稀釋液來(lái)測(cè)定黑化黏蟲(chóng)血淋巴中的酚氧化酶活性。黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)被球孢白僵菌侵染后，經(jīng)20E稀釋液誘導(dǎo)其PO活性顯著增強(qiáng)，幼蟲(chóng)的免疫水平因外源20E誘導(dǎo)而提高。未經(jīng)20E稀釋液誘導(dǎo)的對(duì)照組黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的酚氧化酶活性顯著低于經(jīng)20E稀釋液誘導(dǎo)的試驗(yàn)組。這表明20E處理組的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的體液免疫功能明顯增強(qiáng)。

在昆蟲(chóng)的非特異性免疫中，溶菌酶同樣是非常重要的免疫因子。溶菌酶通過(guò)昆蟲(chóng)的脂肪體分泌釋放到血淋巴中。昆蟲(chóng)在受到外界環(huán)境刺激時(shí)，溶菌酶的活性急劇增加。當(dāng)外界的病原物進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)后，病原體細(xì)胞壁會(huì)在溶菌酶的作用下破裂并使內(nèi)容物溢出，最終病原細(xì)胞破裂死亡。針對(duì)棉鈴蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲(chóng)20E滴度增高，脂肪體中溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。針對(duì)東亞飛蝗Lo-custa migratoria的研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上可被20E顯著上調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白僵菌侵染后的黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)注射20E稀釋液來(lái)測(cè)定黑化黏蟲(chóng)血淋巴中的溶菌酶活性。試驗(yàn)中被侵染的黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)在注射20E稀釋液后，溶菌酶活性的變化與酚氧化酶活性的變化趨勢(shì)大致相同。這同樣表明20E對(duì)黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的體液免疫功能有增強(qiáng)作用。

綜上所述，對(duì)黑化黏蟲(chóng)內(nèi)分泌激素含量的分析表明，黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)被球孢白僵菌侵染后，MH的分泌顯著提高。對(duì)酚氧化酶和溶菌酶活性的分析表明，在注射20E稀釋液后，黑化黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的酚氧化酶活性和溶菌酶活性顯著提高。本試驗(yàn)證明，黑化黏蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)在受到外源病原微生物侵染后，蟲(chóng)體通過(guò)內(nèi)分泌激素對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本文試驗(yàn)結(jié)果對(duì)黑化黏蟲(chóng)免疫機(jī)制和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制間的關(guān)系提供了一定的理論依據(jù)，對(duì)揭示黑化黏蟲(chóng)、防御能力和免疫應(yīng)答三者間聯(lián)系具有重要意義。