白雪　張曉曉　季葦芹等

中圖分類號： S436.421.1 文獻標識碼： A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020260

黃瓜Cucumis sativus是葫蘆科黃瓜屬植物，在我國有2000 多年的栽培歷史，是重要的蔬菜作物。近年來，隨著黃瓜的大面積種植，日光溫室及各種塑料大棚等設施逐年增多，為黃瓜生長提供適宜環(huán)境的同時，也為多種黃瓜細菌性病害的發(fā)生提供了適宜的環(huán)境條件。生產(chǎn)中黃瓜細菌性病害主要有丁香假單胞菌流淚致病變種Pseudomonas syrin?gae pv. lachrymans引起的細菌性角斑病、丁香假單胞菌P.syringae引起的細菌性莖軟腐病、綠黃假單胞菌P.viridiflava引起的細菌性白枯病、嗜管歐文氏菌Erwinia tracheiphila引起的細菌性萎蔫病、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestris pv. cucurbitae引起的細菌性圓斑病和丁香假單胞菌流淚致病變種P.sy-ringae pv. lachrymans、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense引起的細菌性流膠病等。黃瓜細菌性莖枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中的一種新的細菌病害，2003年以來在我國河南以北地區(qū)有不同程度的發(fā)生。該病害可危害黃瓜莖部，造成植株萎蔫，因此稱為黃瓜細菌性莖枯萎病。實驗室前期采集樣品時發(fā)現(xiàn)黃瓜細菌性莖枯萎病的發(fā)病時間集中在每年的10月-12月及次年的1月-2月，溫度低時，植株流膠、枯萎情況更嚴重。黃瓜細菌性莖枯萎?。ㄒ灿腥朔Q為流膠病）的癥狀與角斑病不同，可以侵染葉脈和莖部，且在早春低溫環(huán)境下危害加重。

植物病原細菌通常依據(jù)病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、致病性、生理生化反應以及分子生物學相關(guān)技術(shù)等進行鑒定。常規(guī)PCR 技術(shù)、實時熒光定量PCR 技術(shù)、多位點序列分型（multilocussequencetyping，MLST）技術(shù)、分子標記技術(shù)、BOXPCR 技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序等方法越來越多地用于細菌的鑒定。生理生化反應是鑒定細菌種類的經(jīng)典試驗，如LOPAT 試驗、Ayers碳源利用試驗和GATTa試驗等。BOXPCR 技術(shù)具有操作簡單快捷，易獲得豐富的擴增條帶，不需要菌株的特異性DNA多態(tài)性分析，擴增結(jié)果可直接進行瓊脂糖電泳檢測等優(yōu)點，目前在固氮菌的多樣性研究中已有應用，在類鼻疽假單胞菌Pseudomonas pseudomallei、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、惡臭假單胞菌P.putida等細菌上也有應用的報道。多位點序列分型技術(shù)是由多位點酶電泳（MLEE）衍生出來的分型方法，用看家基因的DNA 序列多態(tài)性代替了同工酶基因產(chǎn)物的酶譜帶型的多態(tài)性，使試驗結(jié)果的可比性和重復性有很大提高，也廣泛應用于動物學和醫(yī)學中。Newberry等通過LOPAT 生理生化反應、BOXPCR 和MLST 等技術(shù)確定了佛羅里達州的西瓜和西葫蘆細菌性葉斑病的病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種。

本實驗室前期通過碳源利用等方法初步鑒定該病害的病原菌為丁香假單胞菌，本研究將進一步明確黃瓜莖枯萎病病原菌的分類地位，并研究溫度對該病害發(fā)生的影響，為黃瓜細菌性莖枯萎病的防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

本試驗菌株如下：黃瓜莖枯萎病菌山東分離物A1～A7、北京分離物B22、遼寧分離物L2和L3，由本實驗室分離并驗證為病原菌;丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachrymans pslb8、丁香假單胞菌丁香致病變種P.syringae pv.syringaepss和丁香假單胞菌番茄致病變種P.syringae pv.tomato DC3000為本研究室保存;丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv. lachrymans NCPPB540～NCPPB543、丁香假單胞菌菜豆致病變種P.syringae pv. phaseolicola psp、丁香假單胞菌降紅致病變種P.syringae pv. atropurpureaNCPPB1328、丁香假單胞菌李死致病變種P.syringae pv. morsprunorum ATCC13395、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種P.syringae pv.actinidiae NCPPB3738、丁香假單胞菌桑致病變種P.syringae pv.mori ATCC19872和丁香假單胞菌猝倒致病變種P.syringae pv.lapsa ATCC10859由中國檢驗檢疫科學院趙文軍研究員惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

KingsB（KB）培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨20g，MgSO₄1.5g，K₂HPO41.55g，丙三醇15mL。

LB培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

蔗糖（葡萄糖）培養(yǎng)基（pH7.0）：胰蛋白胨10g，NaCl5g，蔗糖（葡萄糖）50g。

Thornley培養(yǎng)基（pH 7.0）：蛋白胨1g，NaCl5g，KH₂PO₄0.3g，酚紅0.01g，L精氨酸鹽酸鹽10g。

明膠液化培養(yǎng)基（pH7.0）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，明膠120g。

七葉苷培養(yǎng)基（pH7.0）：蛋白胨5g，酵母粉1g，蔗糖5g，七葉苷1g，檸檬酸鐵0.5g。

肉汁凍培養(yǎng)基（pH7.0）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母粉1g，蔗糖10g。

Ayers培養(yǎng)基（pH 7.0）：NH₄H₂PO₄1g，KCl0.2g，MgSO₄0.2g，酵母粉0.2g，溴百里酚藍（1.6%乙醇溶液）1.5mL，在培養(yǎng)基中加1%待測定的碳素化合物。

酒石酸鹽利用培養(yǎng)基（pH=7.4）：胰蛋白胨10g，NaCl5g，溴百里酚藍（0.2%）12.5mL，酒石酸鉀10g，接種14d后加入等體積1%醋酸鉛試劑。

以上培養(yǎng)基均用去離子水定容至1000mL，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基配方基礎上添加瓊脂，濃度為1.5%。121℃高溫高壓滅菌（含蔗糖的培養(yǎng)基110℃高溫高壓滅菌）20min?？敲顾兀╧anamycin）的最終使用濃度為50μg/mL。

菌株培養(yǎng)條件：28℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3 試劑、藥品及儀器

試驗所用試劑：2×Taq PCR MasterMix、SuperRealPreMixPlus和FastQuentRTKit（天根生化科技（北京）有限公司）;細菌基因組DNA 提取試劑盒（BioTeke）;質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（Axygen）;N，N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽、干酪素、酒石酸鉀半水合物、明膠、檸檬酸鐵、甘露醇和秦皮甲素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;溴百里酚藍、酚紅、DL-高絲氨酸、L-乳酸鈉和（R）-3-哌啶甲酸乙酯犔酒石酸鹽（上海麥克林生

化科技有限公司）;甜菜堿（北京金百特生物技術(shù)有限公司）;醋酸鉛（北京百靈威科技有限公司）。所有PCR 引物的合成和序列測序由六合華大基因（北京）公司完成。

試驗所用儀器：普通離心機、低溫離心機（Eppendorf，德國），凝膠成像分析系統(tǒng)和PCR 儀（BIORAD，美國），超低溫冰箱MDF382E（SANYO，日本），分光光度計（ThermoFisherScientific，美國），Biosceen全自動生長曲線分析儀（Biosceen，芬蘭），pH 計（Sartorius，德國），磁力攪拌器（WiseStir，中國），烘箱（Memmert，德國），DHP120立式恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器廠有限公司）。

1.2 多位點序列分型（犕犔犛犜）試驗

菌株基因組DNA 提取參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，DNA 用去離子水溶解。選取7個管家基因：編碼σ70因子狉狆狅犇，促旋酶基因gyrB，烏頭酸水合酶B基因acnB，檸檬酸合成酶基因cts，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gap，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi和磷酸果糖激酶基因pfk，以A1～A7為供試菌株，NCPPB540 ～ NCPPB543、NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp、pss和pslb8 為對照菌株，對其DNA 進行PCR擴增并測序，擴增引物見表1。

1.3 犅犗犡犘犆犚檢測

以BOX 為單引物（5′CTACGGCAAGGCGACGCTGACG3′），對NCPPB540～NCPPB543、NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp、pss、pslb8和A1～A7菌株提取的DNA 進行PCR 擴增。25μL反應體系：2×TaqPCR MasterMix12.5μL，引物1μL，模板2μL，ddH₂O9.5μL。反應條件為：95℃預變性5 min;95℃變性30s，60℃退火2min，72℃延伸2min，30個循環(huán);72℃延伸10min。BOX 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用自動凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.4 特異性引物犘犆犚擴增與測序

以A1～A7、B22、L2和L3為供試菌株，pslb8為陽性對照，無菌水為陰性對照，用王哲等根據(jù)丁香假單胞菌流淚致病變種的glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase1（犵犪狆1）基因序列設計的特異性引物PslF/R（PslF：5′GTTCGGCGACGCAATCAATG3′， PslR： 5′GTTGACTTCTTCGGCGGTGG3′）進行PCR 擴增（產(chǎn)物大小為179bp）。25μL 反應體系：2×TaqPCR MasterMix13μL，引物各1μL，模板2μL，ddH₂O8μL。反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物送六合華大基因（北京）公司測序。

1.5 病原菌的生理生化反應測定

試驗選取pslb8、pss和DC3000為對照菌株，將供試菌株用KB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，離心收集菌體，加1mL無菌水懸浮，再離心，然后洗去表面培養(yǎng)基，將菌懸液濃度調(diào)至1×10⁸cfu/mL，進行以下試驗：熒光色素的產(chǎn)生、LOPAT試驗（果聚糖的產(chǎn)生、氧化酶反應、馬鈴薯軟腐反應、精氨酸雙水解檢驗和煙草過敏反應）、GATTa 試驗（明膠液化、七葉苷水解、酪蛋白水解和酒石酸鹽的利用）及Ayers碳源利用試驗（甘露醇、甜菜堿、L-酒石酸鹽、DL-高絲氨酸和犔乳酸鈉）。

1.6 不同溫度下病原菌致病力的測定

為了研究溫度對病害發(fā)生的影響，測定20、25℃和28℃條件下病原菌的生長能力和對黃瓜葉片的致病力（30℃條件下由于溫度過高，子葉過早枯萎，無法完成試驗，因此將最高溫度設為28℃）。

采用噴霧接種的方法。A2菌株和pslb8菌株分別用KB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，5000r/min離心10min，棄上清，沉淀用無菌水洗滌，再用無菌水將菌懸液濃度調(diào)至1×10⁶cfu/mL。使用無菌噴頭將菌液接種到4周齡健康的黃瓜植株，每個菌株接種3盆，以無菌水為陰性對照。接種后使用新塑料袋保濕，置于光照氣候培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度分別設置為20、25℃和28℃，L∥D=16h∥8h，相對濕度80%～85%。分別于接種后7、10、14d觀察黃瓜苗發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。試驗重復3次。

1.7 不同溫度下病原菌在寄主體內(nèi)生長能力的測定

參考Johnson等和Ren等的方法，進行部分修改。將A2和pslb8菌株分別用KB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液濃度為OD₆₀₀=0.6，5000r/min離心10min，棄上清，沉淀用無菌水洗滌，再加入無菌水至菌懸液濃度為1×10⁴cfu/mL，以無菌水為陰性對照。使用一次性注射器將菌懸液注入至完全展開的2周齡黃瓜子葉中，注滿整個子葉，每個菌株接種25株苗。分別放置于20、25℃和28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24h取1片子葉觀察發(fā)病情況并拍照，持續(xù)觀察至子葉癥狀不再變化或全部萎蔫。從每個菌株接種的幼苗中選6片子葉，用消毒并滅菌后的打孔器在葉脈左側(cè)中間部位打取大小約為0.5cm²的葉盤，無菌水沖洗表面后使用MP破碎儀器研磨，研磨液連續(xù)稀釋后涂布于KB固體培養(yǎng)基上，28℃孵育24h，統(tǒng)計細菌菌落數(shù)。試驗重復3次。

1.8 不同溫度下病原菌體外生長能力的測定

將A2和pslb8菌株在KB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6，用KB液體培養(yǎng)基調(diào)至菌懸液濃度為1×10⁸cfu/mL，梯度稀釋至1×10⁶cfu/mL，以KB液體培養(yǎng)基為陰性對照，吸取200μL加入到200孔帶標記聚苯乙烯培養(yǎng)板中，放入Biosceen自動生長曲線儀，設置溫度為20、25℃和28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h測定1次菌液OD₆₀₀的吸光值，測定前5s停止振蕩，培養(yǎng)96h，觀察和記錄各菌株的生長情況。每個處理重復4孔，試驗重復3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均使用GraphPadPrism7進行記錄、運算及制圖，使用PASW Statistics18進行分析，采用獨立樣本狋測驗進行相同條件下的不同菌株間差異性分析（置信區(qū)間=0.95）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多位點序列分型（MLST）結(jié)果

通過多位點序列分型試驗，對所研究菌株的7個看家基因rpoD、gyrB、acnB、cts、gap、pgi和pfk進行PCR驗證，測序結(jié)果通過NCBI進行BLAST分析，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以A1和A2為例（圖1），由圖1可知：基于7個看家基因供試菌株與丁香假單胞菌流淚致病變種NCPPB540、NCPPB541、NCPPB542、NCPPB543和pslb8菌株的親緣關(guān)系最近，因此，確定黃瓜細菌性莖枯萎病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachrymans。

2.2 BOX-PCR檢測結(jié)果

BOXPCR試驗，結(jié)果表明，供試菌株與NCPPB540、NCPPB541、NCPPB542和NCPPB543的結(jié)果相同，與NCPPB1328、ATCC13395、NCPPB3738、ATCC19872、ATCC10859、psp和pss不同，說明供試菌株為丁香假單胞菌流淚致病變種（圖2）。

2.3 特異性引物犘犆犚擴增結(jié)果

以特異性引物PslF/R 對黃瓜莖枯萎病菌代表性菌株和對照菌株進行PCR 擴增，得到179bp的目的片段，經(jīng)測序和BLAST 比對分析后，確定供試菌株為丁香假單胞菌流淚致病變種。

2.4 病原菌的生理生化反應

10株供試菌株與pslb8菌株的試驗結(jié)果一致，其在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光，產(chǎn)生果聚糖，煙草過敏性反應、明膠液化和七葉苷水解均呈陽性，精氨酸雙水解、馬鈴薯軟腐和酪蛋白水解均呈陰性，可利用甘露醇、甜菜堿和L-酒石酸鹽，不能利用L-乳酸鈉和DL-高絲氨酸（表2）。與pss菌株在酒石酸鹽、L-酒石酸鹽和犔乳酸鈉利用的試驗結(jié)果不一致;與DC3000菌株在明膠液化、酒石酸鹽和L-酒石酸鹽利用的試驗結(jié)果不一致;由此也可證明該病害的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種。

2.5 不同溫度下病原菌的致病力測定結(jié)果

A2菌株和pslb8菌株噴霧接種健康的黃瓜幼苗，分別在20、25℃和28℃條件下培養(yǎng)，接種后7d調(diào)查黃瓜幼苗發(fā)病情況。20℃時，接種A2菌株的黃瓜苗均比接種pslb8菌株的黃瓜苗癥狀明顯;在25℃和28℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗癥狀與接種pslb8菌株的黃瓜苗無明顯差異。說明20℃條件下黃瓜苗接種A2菌株比接種pslb8菌株更易發(fā)病，但是隨著溫度的升高，接種A2和pslb8菌株的黃瓜苗的發(fā)病程度無明顯差異（圖3a，c，e）。

黃瓜苗噴霧接種A2和pslb8菌株7d后調(diào)查病情指數(shù)：在20℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗第7、10天和14天的病情指數(shù)分別為18.75、48.96和65.63，接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為7.14、20.24和34.67;在25℃條件下，接種A2菌株的黃瓜苗第7、10 天和14 天的病情指數(shù)分別為14.12、32.87和40.74，接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為15.63、35.65和41.43;在28℃條件下，接種A2菌株第7、10天和14天的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為19.5、27.48和38.19;接種pslb8菌株的黃瓜苗的病情指數(shù)分別為19.20、25.00和31.55。在20℃條件下，A2菌株與pslb8菌株的致病性差異顯著（犘<0.05），在25℃和28℃條件下，A2菌株與pslb8菌株的致病性差異不顯著（圖3b，d，f）。由以上結(jié)果表明：在20℃條件下，A2菌株的致病力強于pslb8菌株，在25℃和28℃條件下，A2與pslb8菌株的致病力無明顯差異，20℃條件下更有利于黃瓜莖枯萎病的發(fā)生（圖3）。

2.6 不同溫度下病原菌在寄主體內(nèi)生長能力測定

20℃條件下，注射A2和pslb8菌液的黃瓜子葉在觀察時間范圍內(nèi)未出現(xiàn)萎蔫癥狀，在25℃和28℃條件下，子葉在72h時出現(xiàn)萎蔫癥狀（圖4a，c，e）。

注射A2和pslb8菌液后，20℃條件下，在48h內(nèi)A2菌株與pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長速率無差異，在48h后A2菌株的菌落數(shù)量增長速率加快，在72h時可看出A2菌株與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長率差異顯著（犘<0.05，獨立樣本狋測驗），72h后pslb8菌株的菌落數(shù)量增長速率進入穩(wěn)定期。25℃條件下，24h時A2和pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長速率差異明顯，在48h時，A2與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長速率無明顯差異。28℃條件下，在24h內(nèi)A2菌株與pslb8菌株的菌落數(shù)量增長速率無差異，在48h內(nèi)菌落數(shù)量增長速率最快，48h后A2菌株的增長速率趨于穩(wěn)定，pslb8菌株的增長速率略有下降趨勢（圖4b，d，f）。由以上結(jié)果表明：在觀察時間范圍內(nèi)，20℃條件下，A2菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長速率呈現(xiàn)強于pslb8菌株的趨勢，說明在20℃條件下，A2菌株在寄主體內(nèi)生長能力強于pslb8菌株。在25℃和28℃條件下，A2菌株與pslb8菌株在黃瓜子葉內(nèi)的菌落數(shù)量增長速率無明顯差異。

2.7 不同溫度下病原菌體外生長能力測定

在20℃條件下，A2菌株在第16h進入對數(shù)生長期，在第44h進入穩(wěn)定期，在第92h出現(xiàn)衰退現(xiàn)象;pslb8菌株一直處于生長期且較遲緩;在25℃條件下，A2菌株在第12h進入對數(shù)生長期，第34h進入穩(wěn)定期，在第72h進入衰退期，pslb8菌株生長較遲緩，在第84h進入穩(wěn)定期;28℃條件下，A2菌株在第9h進入對數(shù)生長期，A2菌株在第30h時趨于穩(wěn)定增長，在第60h菌株生長進入衰退期，pslb8菌株生長遲緩，生長期延長。由以上結(jié)果可知：在20℃條件下，A2菌株維持在穩(wěn)定期的時間較長，在3個溫度條件下，pslb8菌株均生長緩慢，隨著溫度升高，pslb8菌株在后期生長速率比A2菌株的生長速率快。說明在20℃條件下，A2菌株的體外生長（72h內(nèi)）能力強于pslb8菌株（圖5）。

通過對黃瓜細菌性莖枯萎病病原菌不同溫度下病情指數(shù)、體內(nèi)和體外生長能力的測定，可以看出，在20℃條件下，A2菌株的生長能力一直強于pslb8菌株，這與20℃條件下A2菌株的致病力強于pslb8菌株的結(jié)論相符。

3 結(jié)論與討論

2003年以來在我國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、山東、山西、河北和河南等地黃瓜細菌性莖枯萎病均有不同程度的發(fā)生。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃瓜的果實、莖稈和葉片均可被侵染。成株期葉片通常從邊緣開始發(fā)病，形成“V”字形或圓形病斑，病斑周圍有黃色暈圈，有時也從葉片中部開始發(fā)病，葉片水浸狀褪綠，后期整個葉片表現(xiàn)腐爛癥狀，嚴重時造成病斑穿孔，病菌可沿葉脈擴展并侵染葉脈。莖稈發(fā)病初期，發(fā)病部位呈水浸狀，有流膠現(xiàn)象，嚴重時可見大量的白色膠狀物質(zhì)溢出，通風干燥后白膠變黃;發(fā)病中期莖稈縱向開裂，表現(xiàn)為軟腐癥狀;發(fā)病嚴重時莖稈由里向外軟腐，造成整株植株萎蔫、死亡。果實發(fā)病病斑呈水浸狀，中后期果實表面流出白色膠狀物，果實內(nèi)部呈現(xiàn)軟腐癥狀，或呈開裂狀，后期黃瓜變黃腐爛。本研究利用生理生化反應對黃瓜細菌性莖枯萎病的病原菌進行了鑒定，同時也用多種分子生物學技術(shù)對病原進行了再確定，即達到了經(jīng)典細菌學鑒定病菌的要求也應用了分子技術(shù)對其快速驗證，最終確定黃瓜細菌性莖枯萎病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種P.syringae pv.lachry-mans，與黃瓜細菌性角斑病及流膠病的病原菌為同一變種。1984年黃仲生等黃瓜細菌性角斑病的病原菌鑒定為P.syringae pv.lachry-mans。李寶聚等在河南、遼寧、山東、山西、天津等地發(fā)現(xiàn)黃瓜細菌性流膠病（初稱為細菌性莖軟腐病，后更改為細菌性流膠?。?。孟祥龍等確定了黃瓜流膠病的病原菌為丁香假單胞菌流淚致病變種和胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種。本實驗室從采集的樣品中只分離到丁香假單胞菌流淚致病變種，沒有分離到高溫下容易引起植物發(fā)病的胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種。本研究結(jié)果表明：黃瓜細菌性莖枯萎病菌株A2和黃瓜細菌性角斑病菌pslb8在不同溫度下的致病力和生長能力并不相同。20℃條件下，A2菌株的致病力、體內(nèi)生長能力和體外生長能力均強于pslb8菌株，說明相對低溫條件下，A2菌株侵染黃瓜的能力更強，相對低溫的條件下更有利于病害的發(fā)生。這與在田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)黃瓜細菌性莖枯萎癥狀主要出現(xiàn)在秋冬以及初春低溫時期相符合。黃瓜角斑病的病斑為近圓形或不規(guī)則病斑，嚴重時病斑連成片且受葉脈限制呈不規(guī)則形，這與黃瓜莖枯萎病的癥狀有所不同。

梨火疫病原梨火疫歐文氏菌犈狉狑犻狀犻犪犪犿狔犾狅狏狅狉犪通過胞外酶果聚糖蔗糖酶降解蔗糖產(chǎn)生β2，6呋喃低聚糖（果聚糖）。植物病原丁香假單胞菌中，細胞外多糖果聚糖蔗糖酶（Lsc）介導胞外多糖—果聚糖的產(chǎn)生。Lsc由兩個功能基因犾狊犮犅和犾狊犮犆編碼，兩個基因為溫度依賴性表達，在18℃時轉(zhuǎn)錄水平最高。LscB和LscC的區(qū)別僅在于5個氨基酸殘基，其中一個是半胱氨酸殘基。溫度響應性表達依賴于果聚糖蔗糖酶（Lsc）基因的特定啟動子以及調(diào)節(jié)該過程的調(diào)節(jié)子。在惡臭假單胞菌犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狆狌狋犻犱犪中犾狊犮犅和犾狊犮犆不誘導果聚糖形成。我們研究證明黃瓜莖枯萎病的病原菌在低溫下具有更強侵染能力，黃瓜莖枯萎病的低溫下發(fā)生是否受犾狊犮犅和犾狊犮犆基因調(diào)控需要進一步研究，以便為病害防控提供科學的理論依據(jù)。