毛 妍，楊夢(mèng)然，梁曾恩妮，鄔 靜，袁莉蕓，袁志航*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125；4.襄陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441022)

桔青霉素(citrinin，CTN)又叫桔霉素，是一種真菌毒素，是由多種青霉屬、曲霉屬和紅曲霉屬真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在自然界中分布十分廣泛。1931年，Raistrick和Hetherington從培養(yǎng)的青霉中首次分離出桔青霉素，1995年Blanc P J證實(shí)紅曲霉素代謝產(chǎn)生的真菌毒素為桔青霉素[1-2]。桔青霉素對(duì)人和動(dòng)物具有多種毒性作用，對(duì)肝、腎、心臟和胃腸道均具有毒性作用，其中肝腎毒性和生殖毒性最為明顯，同時(shí)還可引起細(xì)胞突變進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤，這也使得國(guó)際社會(huì)開始廣泛關(guān)注紅曲產(chǎn)品的安全性[3]。

桔青霉素普遍存在于儲(chǔ)存不良的作物、飼料和食物中，如玉米、小麥、大米、堅(jiān)果等，不慎攝入此類受污染的產(chǎn)品可導(dǎo)致人類和動(dòng)物的疾病和死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)帶來極大的危害[2,4]。本文就桔青霉素的理化特性、檢測(cè)方法和毒性作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為桔青霉素引起的食品安全和畜禽健康危害研究提供參考。

1 桔青霉素的理化特性

桔青霉素常溫下呈檸檬黃色針狀棱形結(jié)晶，分子式為C13H14O5，分子量為250 g/mol，對(duì)熒光敏感，最大紫外吸收值在波長(zhǎng)321 nm～250 nm(乙醇為222 nm～321 nm，3-甲基戊烷為322 nm，氯仿為332 nm)，熔點(diǎn)為178℃～179℃[5]。微溶于水，可溶于稀堿液和氯仿、乙醇和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。桔青霉素可形成螯合復(fù)合物，在酸性及堿性溶液中皆可溶解，易在冷乙醇溶液中結(jié)晶析出[6-9]。桔青霉素在175℃干加熱時(shí)分解，水溶液中分解溫度可降低到140℃，分解形成毒性更強(qiáng)的桔青霉素H1和桔青霉素H2，且對(duì)細(xì)胞的毒性是桔青霉素的10倍[9-10]。

2 桔青霉素的檢測(cè)方法

桔青霉素由多種青霉和曲霉產(chǎn)生，廣泛存在于人類和動(dòng)物的食品中，給人們的食品安全和養(yǎng)殖業(yè)帶來了潛在的危害。1991年，桔青霉素被國(guó)際生命科學(xué)院自然毒素檢測(cè)委員會(huì)歐洲分會(huì)列為必須檢測(cè)的毒素之一[8]。因此，建立對(duì)桔青霉素簡(jiǎn)單、靈敏、便捷的檢測(cè)方法尤為重要。目前對(duì)桔青霉素分析的方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、膠體金免疫層析法[11]。其中酶聯(lián)免疫分析法是較為靈敏的檢測(cè)方法，但需要專用的抗體，費(fèi)用昂貴[6]。高效液相色譜法是目前檢測(cè)桔青霉素使用最為廣泛的方法，具有分離效率高、選擇性好、快速、靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜中藥基質(zhì)中桔青霉素的檢測(cè)[12]。但也存在回收率低的缺點(diǎn)，需要改進(jìn)樣品處理方法，提高回收率。近年來，通過估計(jì)生物體液中的代謝物來評(píng)估個(gè)體對(duì)外源性物質(zhì)的暴露，Ouhibi S等開發(fā)了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，可用于測(cè)定人尿液和血漿中棒曲霉素和桔青霉素[13]。Mandal S等利用桔青霉素官能團(tuán)與鎘相互作用的化學(xué)性質(zhì)，提出黃色發(fā)光碳點(diǎn)和剛果紅超靈敏視覺檢測(cè)桔青霉素的方法，這種檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可靠且重復(fù)性高，無需任何設(shè)備或?qū)I(yè)人員即可實(shí)現(xiàn)，有望廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中真菌毒素的檢測(cè)[14]。Ying Xu等以兩種特異性抗體為偶聯(lián)物，建立了雙熒光免疫層析法，可同時(shí)檢測(cè)玉米樣品中的桔青霉素和玉米赤霉烯酮，具有低檢出限和高回收率的優(yōu)點(diǎn)[15]。Singh G等建立了一種基于多克隆抗體的快速特異性間接酶聯(lián)免疫吸附法(ciELISA)，對(duì)桔青霉素具有很強(qiáng)的特異性，與其他霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，該ciELISA的有效性已經(jīng)得到了驗(yàn)證，并用于小麥和玉米粉樣品桔青霉素的檢測(cè)[16]。

3 桔青霉素的毒性作用

桔青霉素存在嚴(yán)重的生殖毒性、腎毒性[17]和腸道毒性[18-19]；還具有肝毒性，表現(xiàn)為動(dòng)物肝細(xì)胞壞死和膽囊增生等病理變化[20]。桔青霉素通過調(diào)節(jié)脾、腸系膜淋巴結(jié)和小腸中不同的免疫細(xì)胞群，改變小鼠免疫系統(tǒng)的正常功能[21]。桔青霉素在自然界中通常與其他真菌毒素混合存在，研究證實(shí)桔青霉素和其他真菌毒素，如赭曲霉素、展青霉素等聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同作用，增加對(duì)機(jī)體的損害[22]。

3.1 生殖毒性

桔青霉素不僅損傷成年動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，還能夠阻礙生殖細(xì)胞的成熟與胚胎發(fā)育，導(dǎo)致動(dòng)物生殖障礙。Han Q Q等[23]通過對(duì)小鼠的生殖器官相對(duì)重量、精液質(zhì)量、血清睪酮濃度和生育能力進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，桔青霉素能夠顯著增加雄性小鼠的睪丸、附睪和包皮腺的重量，畸形精子數(shù)量增多，精子存活率降低，對(duì)成年雄性小鼠生殖造成不良影響。Aydin Y等[24]以小鼠支持細(xì)胞為模型探討了8種不同濃度的桔青霉素的毒性潛力，結(jié)果表明，桔青霉素能夠通過降低支持細(xì)胞的細(xì)胞活率誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，導(dǎo)致精子和睪丸發(fā)育不良，對(duì)雄性動(dòng)物生殖造成損傷。桔青霉素還通過誘導(dǎo)ROS水平和早期凋亡標(biāo)記物水平升高來促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生，引起小鼠早期的卵母細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，抑制小鼠卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育[25]。

ICR小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)桔青霉素處理后，細(xì)胞內(nèi)線粒體分布出現(xiàn)異常，線粒體膜電位降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)未能向梭形周圍積聚，并伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，高爾基體損傷，LAMP2的表達(dá)量增加，誘導(dǎo)溶酶體損傷；桔青霉素引起小鼠卵母細(xì)胞細(xì)胞器的分布和功能發(fā)生異常，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[26]。

3.2 腎毒性

桔青霉素的毒性作用中腎毒性最為明顯，其主要作用的靶器官是腎臟[9]，可引起犬、豬、大鼠、雞等多種動(dòng)物腎臟損傷病變，且不同物種對(duì)桔青霉素敏感性存在顯著差異，大鼠經(jīng)口LD50為50 mg/kg體重，小鼠為112 mg/kg體重，豚鼠為37 mg/kg體重[8]。病理變化主要表現(xiàn)為腎臟腫大、尿量增多、管狀上皮細(xì)胞變性壞死、腎小球萎縮和尿素氮升高等。將桔青霉素污染的米喂大鼠，導(dǎo)致大鼠生長(zhǎng)緩慢，出現(xiàn)腎臟功能和形態(tài)改變，排尿量增加；病理學(xué)檢查可見腎臟明顯增大，呈灰白色，腎臟重量為對(duì)照組的1.5倍[27]。1977年，Jordan W H等將桔青霉素混入飼料中喂養(yǎng)小鼠，或溶解在氫氧化鈉(NaOH)，或等體積的二甲亞砜(DMSO)和500 mL/L乙醇中，通過腹腔注射、皮下注射和口服等途徑給藥，發(fā)現(xiàn)病變部位主要局限于腎臟，其中包括腎小管擴(kuò)張、腎小管管腔內(nèi)可見蛋白、腎皮質(zhì)小管上皮輕度和中度壞死、髓管上皮有絲分裂活性的增加[28]。懷孕Wistar大鼠攝入摻有桔青霉素的飼料后，導(dǎo)致腎臟發(fā)生病變并影響胎兒腎臟發(fā)育形態(tài)[29]。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在用高劑量桔青霉素處理的大鼠腎皮質(zhì)中，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)記指數(shù)顯著增加，細(xì)胞周期蛋白Ccna2、Ccnb1、Ccne1及其轉(zhuǎn)錄因子E2f1均增加，桔青霉素可直接促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和代償，促進(jìn)ERK磷酸化的發(fā)生，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，通過加快細(xì)胞增殖的方式引起腎臟損傷[30]。

桔青霉素、赭曲霉毒素A和T-2毒素聯(lián)合作用時(shí)，顯著降低了水分子通過水通道蛋白2的滲透系數(shù)，小鼠腎臟的水通道蛋白表達(dá)水平下降，表明真菌毒素存在引起腎源性尿崩癥和腎毒性的可能性[31]。

3.3 肝毒性

單劑量桔青霉素(35 mg/kg)能夠引起肝臟局限性病變，包括肝臟實(shí)質(zhì)和周圍小葉區(qū)的脂肪沉積、肝糖原耗竭和實(shí)質(zhì)有絲分裂增加[32]。研究發(fā)現(xiàn)，桔青霉素作用后，大鼠血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性降低，導(dǎo)致高脂血癥和大鼠肝臟中糖原含量的減少，在單次或多次接觸后，引起大鼠肝臟毒性。動(dòng)物攝入高劑量桔青霉素時(shí)，刺激肝細(xì)胞線粒體中超氧陰離子的產(chǎn)生，發(fā)生氧化應(yīng)激，引起肝細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致動(dòng)物肝臟損傷[20]。桔青霉素能通過抑制NADH氧化酶、NADH還原酶、細(xì)胞色素C還原酶、蘋果酸、谷氨酸及α-酮戊二酸脫氫酶的活性，引起跨膜電壓的降低，抑制肝細(xì)胞線粒體氧化磷酸化效率，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，引起肝臟損傷[8]。

3.4 腸道毒性

許建平等[18]以健康家兔為對(duì)象，研究了桔青霉素對(duì)其小腸平滑肌活動(dòng)的影響。發(fā)現(xiàn)0.1 mg/mL桔青霉素能使家兔小腸運(yùn)動(dòng)的張力和收縮幅度增大，與小腸運(yùn)動(dòng)的正常情況相比差異極顯著；證明桔青霉素對(duì)小腸平滑肌具有興奮作用，有可能導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體胃腸功能紊亂，發(fā)生腹瀉。Salah A等[19]的一項(xiàng)研究表明，桔青霉素誘導(dǎo)的毒性與腸細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑的激活有關(guān)，桔青霉素通過顯著降低人小腸HCT116細(xì)胞的存活數(shù)量，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Salah A等還發(fā)現(xiàn)桔青霉素觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)的不同部分，如GRP78、PDIA6、CHOP和XBP1等蛋白表達(dá)的增加，也能導(dǎo)致發(fā)生細(xì)胞損傷，引發(fā)腸道病變。

3.5 其他毒性

有研究發(fā)現(xiàn)，桔青霉素還具有致癌性和細(xì)胞毒性。其常與其他真菌毒素共同存在，并產(chǎn)生協(xié)同作用，如赫曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)、青霉酸和伏馬菌素等，與OTA同時(shí)存在時(shí)，可以增強(qiáng)OTA對(duì)動(dòng)物的致癌作用[33-34]。桔青霉素通過抑制DNA和RNA合成、線粒體功能的耗竭和促進(jìn)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡或死亡[35]。經(jīng)桔青霉素處理的HCT116細(xì)胞，細(xì)胞活力下降，呼吸爆發(fā)明顯增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的氧自由基，引起細(xì)胞損傷[36]。

4 展望

桔青霉素普遍存在于飼料、谷物與果蔬當(dāng)中，可由多種真菌代謝產(chǎn)生，食用后能夠產(chǎn)生不同的毒性效應(yīng)，其危害范圍廣，且難以避免。其毒性強(qiáng)弱對(duì)機(jī)體的作用有所不同，劑量界定可以更為有效的防控桔青霉素帶來的危害。全面了解桔青霉素的生物學(xué)作用，是保證畜禽養(yǎng)殖業(yè)和飼料加工業(yè)良性發(fā)展的重要依據(jù)?，F(xiàn)有的研究表明，桔青霉素的生物學(xué)作用仍然以毒性作用為主，雖然人們對(duì)生殖毒性的研究早已從早期臨床及病理變化深入到分子生物學(xué)研究，但其誘發(fā)生殖毒性的確切機(jī)制尚不清楚。因此，在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，借助分子生物學(xué)方法來闡明不同物種之間桔青霉素誘導(dǎo)生殖毒性的確切機(jī)制，可以有效抑制桔青霉素造成的生殖毒性，將為桔青霉素誘導(dǎo)不同物種生殖毒性的防控研究提供新思路，為降低畜禽繁殖和養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，保護(hù)人類和動(dòng)物的健康提供支持。