崔恩慧，趙善廷

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

黃芩湯源自《傷寒論》，由黃芩、白芍、大棗、甘草4味中藥組成。方中黃芩味苦，性寒，清熱止痢，可清太陽和少陽經之熱；白芍味苦、酸，性微寒，和營止痛；大棗味甘，性溫，補脾和胃，益氣生津；甘草性平，味甘，補脾益氣、調和諸藥。4味藥合方共奏清熱止痢、和中止痛之效。黃芩湯治療胃腸道疾病已有數(shù)千年歷史[1]。大量藥理研究表明，黃芩湯活性成分具有抑制細菌生長[2]、抗炎[3]、調節(jié)免疫[4]、抑制腫瘤[5]等作用。類黃酮是黃芩中的主要成分，具有抗炎、抗病毒和調節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[6]。白芍中的總苷也有抗炎和免疫調節(jié)作用[7]。甘草中的黃酮、三萜皂苷和異黃酮衍生物具有抗炎、抗癌和抗氧化作用[8]。棗中的三萜和多糖具有抗炎和免疫生物學活性[9]。研究表明，黃芩湯對豬腹瀉也有很好的療效，但其治療機制尚未見報道。為了探索黃芩湯治療豬腹瀉的作用機制，本研究采用網絡藥理學方法全面探究了黃芩湯治療豬腹瀉的潛在作用機制，為黃芩湯在治療豬腹瀉中的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃芩湯活性化合物-靶點網絡圖的構建

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)[10]檢索了黃芩湯中4味中藥的化學成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability,OB)≥50和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18對所有單味藥化合物進行初步篩選[11]。篩選結束后，通過PharmMapper[12]對相關活性成分作用靶點進行預測。利用Cytoscape3.8.2構建化合物-靶點網絡，探究黃芩湯治療疾病的作用機制。

1.2 豬腹瀉靶點檢索

將“Susscrofa”和“diarrhea”作為關鍵詞，在NCBI數(shù)據(jù)庫Gene中檢索豬腹瀉靶點。

1.3 PPI網絡構建和關鍵靶點篩選

通過BisoGenet插件，將黃芩湯靶點和豬腹瀉疾病靶點分別映射到PPI網絡，同時利用Cytoscape3.8.2對兩個PPI取交集，獲得黃芩湯和豬腹瀉的交集網絡。

采用網絡拓撲分析插件Cyto NCA[13]對交集網絡進一步篩選，選出度值大于所有節(jié)點度值2倍中位數(shù)的節(jié)點，即“Big hubs”；篩選網絡中的關鍵節(jié)點，再篩選其他幾個指標大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點，即關鍵基因。上述獲得的相關化學成分及靶點則有可能是黃芩湯治療豬腹瀉的直接或間接作用環(huán)節(jié)。

1.4 靶點GO富集及KEGG通路富集分析

通過David在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，利用Cytoscape3.8.2構建靶點-信號通路網絡。

2 結果

2.1 黃芩湯有效成分的篩選

從TCMSP中檢索黃芩湯的化學成分，確定篩選條件后最終收集黃芩湯有效成分65個(黃芩7個、白芍7個、大棗9個、甘草42個)，去除單味藥重復成分后共獲得62個活性成分。根據(jù)活性成分來源進行重命名，黃芩的第1個成分重命名為HQ1，第2個成分重命名為HQ2，黃芩、白芍、大棗中共有的成分重命名為A1，白芍、大棗中共有的成分重命名為B1。

2.2 黃芩湯活性成分靶點的收集和篩選

將黃芩湯活性成分通過PharmMapper預測靶點，得到黃芩靶點36個，白芍靶點106個、大棗靶點61個、甘草靶點81個，合并后刪除重復值共得到121個靶點。將結果導入cytoscape3.8.2軟件，構建黃芩湯有效成分-靶點網絡(圖1)。如圖1所示，化合物-靶點網絡共包括61個化合物節(jié)點、121個靶點節(jié)點和1 328條邊，黃芩、白芍、大棗和甘草的化合物由六邊形節(jié)點代表，A1為白芍、大棗和甘草的共同化合物，B1為白芍和大棗的共同化合物，菱形節(jié)點代表靶點，節(jié)點大小與度值成正比。在黃芩湯治療豬腹瀉網絡中，具有較大度值的化合物包括MOL001924、MOL001918、MOL000211、MOL004810和MOL004863，見表1。

六邊形節(jié)點分別代表黃芩、白芍、大棗和甘草的化合物，A1為白芍、大棗與甘草的共同化合物，B1為白芍和大棗的共同化合物，菱形節(jié)點代表靶點。

表1 黃芩湯度>35的活性化合物基本信息

2.3 黃芩湯治療豬腹瀉的PPI構建與關鍵靶點篩選

2.3.1 黃芩湯治療豬腹瀉的蛋白相互作用 將藥物靶點和豬腹瀉靶點分別輸入BisoGenet插件獲得PPI網絡，對兩個PPI取交集，獲得黃芩湯和豬腹瀉的交集網絡見圖2。

圖2 黃芩湯-豬腹瀉交集網絡圖

2.3.2 黃芩湯治療豬腹瀉的關鍵靶點 通過Cyto NCA對黃芩湯治療豬腹瀉的PPI交集網絡進行分析，篩選條件為度值大于70(2倍中位數(shù))得到Big hubs，再通過連接度、介度、緊密度、局部邊連通性和網絡中心性的中位數(shù)進一步篩選得到黃芩湯治療豬腹瀉直接或間接作用的55個關鍵節(jié)點。篩選策略示意圖見圖3。將55個關鍵節(jié)點導入到String11.0數(shù)據(jù)庫中分析PPI，如圖4A，導出表格文本輸出(.tsv)，然后導入Cytoscape(3.8.2)繪制目標交互的網絡圖。節(jié)點的大小和顏色與度數(shù)成正比，節(jié)點越大，顏色越深，它在網絡中的重要性就越大；連線的粗細和顏色與度數(shù)成正比，線越粗、顏色越深與其有關系的靶點越多，如圖4B。為了更好地理解黃芩湯治療豬病的作用機制，根據(jù)節(jié)點的度繪制的前18個靶點蛋白的條形圖見圖5。由圖5可知，黃芩湯與豬腹瀉靶點中核仁磷酸蛋白(NPM1)、熱休克蛋白5(HSPA5)、真核翻譯延伸因子1A1 (EEF1A1)、核不均一核糖核蛋白A1(HNRNPA1)等互作的頻率較大。

連接度( Degree) 、介度( Betweenness) 、緊密度( Closeness) 、局部邊連通性( Local average connec-tivity，LAC)和網絡中心性( Network centrality，NC)。

A.關鍵靶點PPI網絡圖；B.黃芩湯治療豬腹瀉關鍵靶點的相互作用網絡。A.PPI network diagram of key targets.B.Interaction network of targets for Huangqin decoction against diarrhea of Sus scrofa.

圖5 PPI網絡圖中關鍵靶點的度

2.4 生物功能和途徑的富集分析

為了進一步探討黃芩湯治療豬腹瀉的作用機制，將55個關鍵節(jié)點導入David數(shù)據(jù)庫。對黃芩湯治療豬腹瀉的靶點進行GO富集(圖6)和生物通路分析(圖7)。圖6顯示，在GO富集分析的生物過程中，黃芩湯對翻譯、凋亡過程的負調控有很大的影響。在細胞成分中，黃芩湯對細胞外泌體、細胞膜、黏著斑、核仁有影響。在分子功能中，黃芩湯對RNA結合蛋白、核糖體的結構成分、核苷酸的結合影響較大。圖7顯示黃芩湯治療豬腹瀉的1條通路核糖體通路。具體參數(shù)見表2。

表2 KEGG信號通路信息(錯誤率<0.05)

3 討論

網絡藥理學是各種信息學方法的整合，可以從藥物成分-靶點-疾病多角度分析，全面系統(tǒng)地探索藥物對疾病的作用機制，與中藥治療疾病的整體性和系統(tǒng)性一致。本研究通過TCMSP平臺，根據(jù)口服利用度和類藥性參數(shù)，從中藥數(shù)據(jù)庫中篩選出黃芩湯有效成分，對有效成分進行潛在活性成分和作用靶點的關系網絡繪制，得到可能的靶點。

1.翻譯；2.翻譯調控；3.凋亡翻譯負調控；4.翻譯正調控；5.平滑肌細胞增殖調控；6.DNA修復；7.通過非同源端連接修復雙鏈斷裂；8.紡錘體組裝；9.粘著斑；10.細胞膜；11.胞外外泌體；12.細胞質核糖核蛋白體；13.轉錄因子復合體；14.核仁；15.胞質小核糖體亞基；16.胞質大核糖體亞基；17.催化第二步剪接體；18.核染色體，端粒區(qū)；19.紡錘體極中心體；20.cop9信號體；21.多核糖體；22.多聚(A) RNA 結合；23.核糖體的結構組成；24.RNA結合；25.核苷酸結合；26.泛素蛋白連接酶結合；27.轉錄輔激活因子活性

黃芩湯主要活性成分為芍藥苷、黃芩素、甘草素等黃酮化合物，它們在止瀉、抑菌、抗炎等方面有不同程度的藥理作用。芍藥苷可抑制軟骨細胞炎癥及延緩軟骨退變，還可以減輕小鼠潰瘍性結腸炎。黃芩素有抗腫瘤作用[14]，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌都有抗菌活性[15]，然而黃芩素口服利用度為33.52，由于不符合篩選條件而沒有入選。甘草中黃酮類化合物大部分具有較高抑菌活性[16]，甘草素可抑制小膠質細胞在LPS刺激下的炎癥反應[17]，保護LPS誘導的軟骨細胞增殖，并抑制其凋亡[18]。根據(jù)以上結果可知，黃芩湯的有效成分之間存在協(xié)同，而協(xié)同調控的靶點也在腹瀉的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮不同作用，具有治療腹瀉的潛力。PPI分析表明，黃芩湯治療豬腹瀉關鍵靶點主要是NPM1、HSPA5、EEF1A1、HNRNPA1等。研究顯示，核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)基因突變是急性髓系白血病中最常見的分子遺傳學異常[19]。熱休克蛋白5(HspA5)是一種內質網應激的關鍵因子，主要通過內質網應激途徑參與炎癥性腸病的進程[20]。真核翻譯延伸因子1A1(eEF1A1)是真核細胞中高度保守的GTP結合蛋白，在蛋白質合成過程中起著重要作用[21]。核不均一核糖核蛋白A1(HNRNPA1)主要參與病毒侵染和應激恢復[22]。在KEGG通路富集中發(fā)現(xiàn)1條信號通路，為核糖體信號通路，它與黃芩湯中的核糖體蛋白S4(RPS4X)、核糖體蛋白S3(RPS3)、核糖體蛋白L24(RPL24)、核糖體蛋白L13(RPL13)、核糖體蛋白S3A(RPS3A)、核糖體蛋白S2(RPS2)和核糖體蛋白L7(RPL7)有關。

圓形節(jié)點代表關鍵目標；箭頭代表路徑；邊緣代表它們之間的相互作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法探究了黃芩湯治療豬腹瀉的活性成分、核心靶點和信號通路，下一步將進行試驗驗證，以便更好地推進黃芩湯在畜牧養(yǎng)殖中的開發(fā)應用。