陳 亮，劉雪松，張 蕾，沈思思，蘭世捷，李 丹，苗 艷，馮萬(wàn)宇，黃寶銀，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

林可霉素(lincomycin)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種林可胺類堿性抗生素，分子式為C18H34N2O6S[1]。林可霉素對(duì)于細(xì)菌產(chǎn)生抗菌效果的作用機(jī)理是林可霉素與細(xì)菌的核蛋白體50 S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，阻礙了蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到相應(yīng)的抗菌效果[2-3]。林可霉素屬于窄譜抗菌藥物，主要對(duì)化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及肺炎鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌效果較強(qiáng)。對(duì)于部分厭氧菌，如破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌以及雙歧桿菌等有良好的效果。但對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)抗菌效果[4]。林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)還沒有報(bào)道過。因此，本文探究了林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，以期為林可霉素在安格斯牛上的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 安格斯牛5頭，160 kg～200 kg，購(gòu)于齊齊哈爾周邊牧場(chǎng)。

1.1.2 藥品及試劑 林可霉素對(duì)照品，中國(guó)獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品；硼砂以及色譜級(jí)磷酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；色譜級(jí)甲醇以及乙腈，北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LC20-AT液相色譜儀、SPD-M20A二級(jí)陣列管檢測(cè)器、InertSustainC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，確定了高效液相色譜測(cè)定林可霉素的檢測(cè)方法。0.05 mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.1)-甲醇(1∶1)為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm[4]。

1.2.2 血漿樣品處理 精密吸取1 mL血漿，向其加入2 mL乙腈，充分渦旋1 min。12 000 r/min離心10 min，移取上清液到10 mL離心管中，60℃氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相進(jìn)行定容，過膜后檢測(cè)。

1.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用外標(biāo)法。將不含藥物的血漿按照1.2.2的方法進(jìn)行前處理，以獲得空白血漿基質(zhì)。取5根離心管，各管內(nèi)加入900 μL空白血漿基質(zhì)。將林可霉素稀釋成適當(dāng)濃度，各管分別加入100 μL相應(yīng)濃度的藥物，渦旋均勻，使基質(zhì)加標(biāo)濃度為5 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL。按照1.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R)。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 將林可霉素加入到空白血漿中，使空白血漿中含有林可霉素濃度為5 ng/mL、50 ng/mL、500 ng/mL。按照1.2.2的方法進(jìn)行前處理。按照1.2.1的方法進(jìn)行濃度測(cè)定。將經(jīng)過前處理的血漿樣品的分析峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線中的藥物峰面積進(jìn)行比較。做5個(gè)重復(fù)，共做3個(gè)批次，不同批次間隔1 d，分別計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.2.5 藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)以5 mg/kg的劑量進(jìn)行肌肉注射給藥。給藥后分別于0.17 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h靜脈采血3 mL置于肝素鈉采血管中，以3 500 r/min離心10 min，取血漿于-20℃中保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS軟件中的方差分析處理，藥物代謝動(dòng)力學(xué)模擬及參數(shù)計(jì)算采用Winnonlin 5.2.1軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

根據(jù)1.2.1的檢測(cè)方法和1.2.2的血漿前處理方法，林可霉素在標(biāo)液、基質(zhì)加標(biāo)以及采集的樣品中能在色譜柱上得到良好的分離、保留。該方法對(duì)林可霉素響應(yīng)值高，藥物周圍無(wú)雜質(zhì)峰干擾。林可霉素出峰時(shí)間為10.65 min～10.75 min，在不同批次間分析物出峰時(shí)間有細(xì)微差別。

圖1 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 空白血漿色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以定量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。林可霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.060 5x-2.157 6，相關(guān)系數(shù)為0.998 3。表明林可霉素在5 ng/mL～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 血漿樣品色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明林可霉素在血漿中回收率為91%～101%。批間精密度為2.34%～3.56%，批內(nèi)精密度為1.57%～3.69%。檢測(cè)限(LOD)、定量限 (LOQ)分別為5 ng/mL和10 ng/mL。

2.4 藥物代謝動(dòng)力學(xué)

經(jīng)過高效液相色測(cè)定藥物濃度后，藥時(shí)曲線如圖4以所示。血漿中藥物濃度如表1所示，經(jīng)過Winnonlin軟件分析后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。結(jié)果分析表明，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)吸收較快，代謝較慢，達(dá)峰濃度較高。

表1 血漿中藥物濃度

表2 林可霉素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖4 藥時(shí)曲線

3 討論

林可霉素在不同基質(zhì)中的檢測(cè)方法眾多，其中包括了高效液相色譜法、膠體金免疫層析法、氣相色譜法、質(zhì)譜法以及光譜法等[5]。本試驗(yàn)方法采用了HPLC-DAD方法，并且簡(jiǎn)化了樣品前處理的方法。通過本方法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好、方法專屬性強(qiáng)，并且林可霉素周圍無(wú)雜質(zhì)峰干擾。應(yīng)用該方法可以有效測(cè)定血液中林可霉素的含量。

本次試驗(yàn)測(cè)定的林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為0.37 h，表明達(dá)峰時(shí)間較快，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的吸收較快。達(dá)峰濃度(Cmax)為6.12 μg/mL，說(shuō)明林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的濃度較高。本次試驗(yàn)中，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的消除半衰期(T1/2β)為3.75 h，與范惠敏等測(cè)定的在豬體內(nèi)的3.38 h、Sreedharan等測(cè)定的在水牛體內(nèi)的3.3 h、Albarellos等在貓?bào)w內(nèi)測(cè)定的3.56 h相近，低于吳海港等測(cè)定的環(huán)丙沙星-林可霉素長(zhǎng)效注射液在豬體內(nèi)的10.74 h，高于Abo-EL-Sooud等測(cè)定的在山羊體內(nèi)的1.44 h。本次試驗(yàn)測(cè)得林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的平均滯留時(shí)間(MRT)為3.78 h，與在豬體內(nèi)的3.52 h相似，低于在水牛體內(nèi)的4.32 h，但高于山羊的1.19 h。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明林可霉素在不同動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)具有種屬差異性。林可霉素的抗菌譜與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌譜相似，國(guó)外的一項(xiàng)研究表明，林可霉素血藥濃度達(dá)到2～2.8 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)菌有較為明顯的抗菌效果[11]。在臨床應(yīng)用時(shí)，林可霉素經(jīng)常與其他藥物聯(lián)合配伍使用，既是為了防止細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，也是為了抗混合感染中對(duì)林可霉素敏感性低或無(wú)敏感性的細(xì)菌。林可霉素與大觀霉素的配伍較常見。許多研究報(bào)道稱，這兩種藥的配伍使用可以補(bǔ)充兩種藥物的短板，對(duì)治療細(xì)菌以及支原體疾病有著良好的效果，兩種藥物聯(lián)合使用的抗菌效果要優(yōu)于單藥的使用[4,12-13]。

藥動(dòng)-藥效學(xué)同步模型是一種可以通過科學(xué)計(jì)算得出某種藥物對(duì)于不同的動(dòng)物的合理用藥劑量的模型[14-15]。這個(gè)模型主要包括了兩個(gè)部分，一個(gè)是藥動(dòng)學(xué)研究部分，另一個(gè)是藥效學(xué)研究部分。本試驗(yàn)首次測(cè)出了林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，為林可霉素治療安格斯牛疾病提供了依據(jù)，也可以應(yīng)用相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)為林可霉素的合理用藥提供參考數(shù)據(jù)，防止耐藥性的產(chǎn)生。