謝成運，程 璐，張 娟，李勤凡,2*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學院，新疆烏魯木齊 830052)

奶牛乳房炎是目前全世界奶牛生產中最常見、最難防治的疾病之一，是制約乳業(yè)發(fā)展的重要因素，也是奶牛被淘汰的三大疾病之一，全世界每年因奶牛乳房炎造成的損失巨大[1-3]。以往治療該病濫用抗生素，使致病菌對常用的抗生素產生了一定的耐藥性，從而降低了抗生素的療效，甚至導致奶牛泌乳能力下降，而且牛奶中有抗生素殘留影響人的健康[4]。隨著國家對乳制品質量有了更嚴格的標準，以及人們對乳品安全的要求不斷提高，臨床治療奶牛乳房炎的常用抗生素逐步被限用或禁用[5]。

中藥富含多種抑菌活性物質，屬純天然制品，具有無殘留、無耐藥性等優(yōu)點，對病原菌有著直接或者間接的殺滅作用，廣泛應用于畜禽疾病防治[6]。為此，本文進行了20味中藥對陜西奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌試驗，旨在篩選出對乳房炎致病菌有良好抑菌效果的藥物，指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 五倍子、大黃、黃連、丹參、黃柏、甘草、石榴皮、黃芩、苦參、連翹、蒲公英、地膚子、蒲黃、紅花、金銀花、蛇床子、烏梅、益母草、鹿蹄草、魚腥草共計20味中藥，購于楊凌同仁堂大藥房。

1.1.2 菌株 菌株分離自陜西不同奶牛場臨床乳房炎病例乳樣，鑒定、保存于西北農林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)臨床診斷學實驗室，選取大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌、產色葡萄球菌以及金黃色葡萄球菌等5種菌為供試菌。取出在-80℃保存的菌株，室溫解凍復蘇后，接種于無菌LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)復壯，隨后用滅菌生理鹽水稀釋至1×105CFU/mL～2×105CFU/mL后備用。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(BD115)，德國Binder公司產品；移液槍(100 μL)，德國Eppendorf公司產品；高壓滅菌鍋(HV-85)，日本Hirayama公司產品；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；電磁爐，廣東美的集團產品。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取液制備 20味中藥每味各稱取30 g，碾碎后浸泡于300 mL蒸餾水中，煎煮3次，每次30 min，合并3次濾液濃縮至30 mL，得到最終濃度為1 g/mL的藥液，隨后高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中藥抑菌試驗 參照文獻[7]進行瓊脂擴散法的操作，在無菌條件下，用滅菌“L”型玻璃棒將菌液均勻地涂抹在瓊脂平板上，6 mm打孔器打孔，火焰短暫加熱封底，分別在孔內加滿不同的中藥提取液。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑。重復3次，計算平均值，結果按照《中藥藥理學》標準判定。

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)測定和最低殺菌濃度(MBC)測定 參照文獻[8]使用微量稀釋法測定MIC和MBC。

1.2.4 組方的制備及效果觀察 分析20味中藥抑菌試驗結果，選取效果較好的中藥為主藥，按照中藥組方原則加入其他中藥配伍而成。最后得到組方1(以五倍子、烏梅、黃芩為主要成分)、組方2(以五倍子、烏梅為主要成分)和組方3(以烏梅、黃連為主要成分)3種組方。采用水煎法制備提取液，減壓濃縮至含藥量1 g/mL，按1.2.3方法測定。

2 結果

2.1 中藥抑菌試驗

不同中藥對不同病原菌的抑菌效果不同。黃芩、五倍子、烏梅、鹿蹄草和丹參對產色葡萄球菌為極敏，其中五倍子效果最佳；五倍子、烏梅對金黃色葡萄球菌為極敏，其中五倍子的效果最佳；五倍子、烏梅對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌為中敏，其中烏梅效果最佳；黃連、烏梅對無乳鏈球菌為極敏，其中烏梅效果最佳(表1)。

表1 牛乳房炎主要致病菌的中藥體外抑菌試驗結果

2.2 MIC和MBC的測定

黃連、黃芩、五倍子、石榴皮、烏梅、鹿蹄草對五種供試菌的抑菌效果良好。并且五倍子對金黃色葡萄球菌、產色葡萄球菌和無乳鏈球菌的抑菌效果最佳，其中對金黃色葡萄球菌和產色葡萄球菌的MIC和MBC均為0.001 g/mL，對無乳鏈球菌的MIC和MBC分別為0.002 g/mL和0.008 g/mL；烏梅對大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌體外抑菌效果最佳，其中對大腸埃希氏菌的MIC和MBC分別為0.008 g/mL和0.016 g/mL，對肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分別為0.016 g/mL 和0.031 g/mL(表2)。

表2 中藥對供試菌的MIC和MBC試驗結果

2.3 中藥組方抑菌試驗

3種組方對3種革蘭氏陽性菌抑菌效果為極敏，對2種革蘭氏陰性菌抑菌效果為中高敏，且組方效果明顯都高于單味中藥，其中以五倍子、烏梅為主要成分的組方2效果最好(表3)。

表3 組方對奶牛臨床型乳房炎致病菌的藥敏試驗結果

3 討論

在中醫(yī)中，奶牛乳房炎被稱為奶牛的“乳癰”，“因飼養(yǎng)管理不當、久臥濕熱之地導致毒氣侵害乳房；或因肝郁氣滯、乳絡失暢而致乳房氣血凝滯，瘀結生癰”，會極大的影響牛奶的品質，甚至使得奶牛淘汰，對生產造成極大損失[9-10]。一般的養(yǎng)殖企業(yè)會選擇在發(fā)病時對患病動物用抗生素治療，中藥的治療作用往往被忽視。因此，可以參照本試驗結果，以抗菌消炎、活血化淤為主要醫(yī)治原則，建立一個以中藥為主，同時和抗生素結合使用的療法，以達到中西醫(yī)結合，全面治療奶牛臨床型乳房炎的成果。

從試驗結果可知，不同中藥抑菌的有效成分不同，效果相差甚遠。五倍子抑菌的主要有效成分為五倍子單寧和鞣酸；烏梅抑菌的主要有效成分為苦杏仁苷、蘋果酸、枸櫞酸等物質；黃連的主要有效成分為小檗堿；黃芩的主要有效成分為黃芩素、黃芩苷元等物質；鹿蹄草的主要有效成份為鹿蹄草素、沒食子酸、金絲桃甙等物質；石榴皮的主要有效成分為黃酮苷、沒食子酸等物質，中藥成分間的差異，必然導致了各中藥抑菌效果有所不同[11-16]。其次，中藥的成分復雜，可能本試驗所用的水提法對部分有效成分提取效率不高，而導致了結果的偏差。此外，不同細菌對于同種中藥的敏感性也不盡相同，即使都使用五倍子，五種供試菌所得結果也相差巨大。最后，中藥的產地、采收季節(jié)、用藥部位、濃度和品質都可能會對結果產生影響。

在組方試驗中，在選擇體外抑菌效果較好的中藥為主要成分獲得一個兼具體外抗菌效果良好、制藥便利和用藥方便的組方的同時，也不能忽略其余抑菌效果不佳的中藥，因為部分中藥的主要作用不是抑菌，而是活血化淤、清熱燥濕、提高機體免疫力、加快機體的恢復、緩解機體的不適感等其他重要功能。

此外，以往的試驗都是以金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸埃希氏菌作為主要研究對象，而忽略了產色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等其他細菌對乳房炎的致病作用，本實驗室所采病樣中產色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的分離率較高，并且有文獻認為產色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌同樣也是重要致病菌[17-18]。本試驗在前人研究的基礎上，增加了對產色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的相關試驗，獲得了20味中藥對所選5種致病菌的體外抑菌試驗結果，為后續(xù)相關的研究奠定了基礎。