蘇戰(zhàn)強(qiáng)，馬曉玉，張 毅，張 凌，艾柯代·吐魯洪，佟盼盼

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

雞白痢和雞傷寒分別是由雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌引起的，是嚴(yán)重危害我國種雞健康的兩大沙門氏菌病，兩者都可以導(dǎo)致家禽出現(xiàn)敗血癥、白痢，可垂直傳播[1-2]。一般情況下，雞白痢沙門氏菌多侵害幼雛，發(fā)病雞群最高死亡率可達(dá)100%，而雞傷寒沙門氏菌病則主要發(fā)生于青年雞和成年雞，感染雞病死率與菌株的毒力有關(guān)，病死率一般為10%～25%[3-5]。

目前，雞白痢和雞傷寒仍然是危害我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病，尤其是針對種雞場和孵化場[6]。我國地方種雞雞白痢和雞傷寒凈化不徹底，被感染的種雞產(chǎn)蛋帶菌率約為33%，種蛋污染并被逐代放大，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[7-8]。在無法凈化的情況下，許多雞場都用藥物進(jìn)行防控，使得沙門氏菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，不但危害家禽業(yè)的健康發(fā)展，同時威脅人類的健康[9]。

2019年1月，新疆米泉某種雞場雞群出現(xiàn)產(chǎn)蛋率低，雛雞成活率低，不斷出現(xiàn)零星死亡現(xiàn)象，懷疑發(fā)生沙門氏菌感染。為查明該雞場沙門氏菌的感染情況，本研究采用平板凝集試驗法對該雞場種雞和商品蛋雞進(jìn)行了雞白痢和雞傷寒沙門氏菌病血清學(xué)調(diào)查，采集肛拭子進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，確定感染菌的類型以及耐藥性情況，以期為沙門氏菌感染的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原(配套平板凝集實驗卡)，北京賽諾利康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；BHI肉湯(HB8478)、BPW(HB4084)、RVS肉湯(HB4198)、HE瓊脂(HB4093)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(HB4088-2)，青島海博生物科技有限公司產(chǎn)品；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(CRM004)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限責(zé)任公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Green Mix，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.1.2 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(GSX1)，美國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠電泳成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2019年1月，對新疆米泉某雞場537只拜城油雞進(jìn)行沙門氏菌血清學(xué)篩查，包括蛋雞453只、種雞84只。采集平板凝集試驗強(qiáng)陽性雞的肛拭子55份。

1.2.2 平板凝集試驗 參考雞白痢雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原說明書的方法操作，用移液槍吸取抗原50 μL，垂直滴于平板凝集試驗卡上，再使用獸用9號針頭將雞的翅靜脈刺破，用移液槍吸取50 μL血液與抗原混合均勻，并涂散至直徑約2 cm的液面。2 min內(nèi)讀取結(jié)果，血清出現(xiàn)100%凝集為強(qiáng)陽性，血清出現(xiàn)50%凝集為弱陽性，血清不發(fā)生凝集為陰性。

1.2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將平板凝集強(qiáng)陽性的雞肛拭子分別置于BPW中預(yù)增菌，37℃培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)種于RVS選擇性增菌液中，34℃培養(yǎng)過夜，劃線接種于HE瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h。挑取3～5個典型單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 分離菌株的鑒定 首先進(jìn)行生化鑒定，將新鮮的單菌落接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄試驗結(jié)果；然后進(jìn)行PCR鑒定，把分離株接種至肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后，通過煮沸法提取DNA制備模板。PCR擴(kuò)增沙門氏菌特異性invA基因，長度為202 bp[10]。PCR總反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Green Mix 12 μL，ddH2O10 μL，上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA模板1 μL。

反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 分離沙門氏菌的血清分型 根據(jù)文獻(xiàn)[11]設(shè)計合成擴(kuò)增ratA基因的引物，通過基因組差異區(qū)(ROD)來辨別雞傷寒或雞白痢沙門氏菌。用此引物擴(kuò)增分別產(chǎn)生兩種單一產(chǎn)物，1 047 bp條帶判定為雞傷寒沙門氏菌，243 bp條帶判定為雞白痢沙門氏菌。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性1 min，63℃退火30 s，72℃延伸 60 s，共25個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，然后進(jìn)行成像分析。

1.2.6 分離菌的藥敏試驗 采用CLSI推薦的K-B法對分離株進(jìn)行18種抗生素的藥物敏感性檢測。先將菌株接種在MH肉湯中，37℃培養(yǎng)12 h后，調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用滅菌棉簽均勻涂布在MH平板上，再貼藥敏片，37℃培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄，參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

表1 本研究中用到的引物

2 結(jié)果

2.1 平板凝集試驗結(jié)果

該種雞場的雞白痢和雞傷寒沙門氏菌病抗體陽性率為19.6%(105/537)，蛋雞和種雞陽性率分別為20.5%(93/453)和14.3%(12/84)(表2)。平板凝集試驗強(qiáng)陽性雞有55只，共采集肛拭子樣品55份。

表2 不同用途雞白痢和雞傷寒沙門氏菌病的血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)共得到3株疑似菌，他們在HE瓊脂上形成墨綠色、中心呈黑色的菌落(圖1)；疑似菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上呈紫色、表面光滑、露珠樣的菌落(圖2)。取單菌落進(jìn)行鏡檢，可觀測到革蘭氏陰性短桿狀菌體(圖3)。

圖1 分離菌株在HE上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌株在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 分離菌革蘭氏染色結(jié)果(100×10)

2.3 分離菌株的鑒定

生化鑒定結(jié)果(表3)顯示，3株分離菌的生化鑒定反應(yīng)均為三糖鐵斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫；賴氨酸脫羧酶、衛(wèi)矛醇反應(yīng)陽性，枸櫞酸鹽利用試驗陽性；尿素，氰化鉀、山梨醇、水楊素、色氨酸、鳥氨酸脫羧酶、丙二酸鹽和OPNG反應(yīng)均陰性。結(jié)果顯示，與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中禽傷寒沙門氏菌的生化結(jié)果一致，因此初步確定分離菌株為禽傷寒沙門氏菌。

表3 分離菌株生化實驗結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示，3株分離菌invA基因陽性(圖4)，因此確定3株分離菌均為禽沙門氏菌。沙門氏菌分離率為5.5%(3/55)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；-.陰性對照；+.陽性對照；1～3.分別為3株分離菌株培養(yǎng)物invA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4 分離沙門氏菌的血清分型

PCR血清分型結(jié)果顯示，3株菌均可擴(kuò)增出1 047 bp目的條帶(圖5)，因此確定3株分離菌均為雞傷寒沙門氏菌。

2.5 分離沙門氏菌的藥敏試驗

在3株雞傷寒沙門氏菌中，有1株菌(XJMQ-S39)呈多重耐藥表型，該菌對β-內(nèi)酰胺類(頭孢噻肟、氨芐西林、氨曲南、哌拉西林和氯霉素)、磺胺類(磺胺甲基異惡唑)、四環(huán)素類(四環(huán)素)、氨基糖苷類(鏈霉素)和喹諾酮類(環(huán)丙沙星)耐藥，對左氧氟沙星和多黏菌素B呈中度敏感，對頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星敏感。其余2株對多黏菌素B均呈中度耐藥，對其他藥物均敏感。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；-.陰性對照；1～3.分別為3株分離菌株培養(yǎng)物ratA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

3 討論

雞沙門氏菌病是家禽最常見的傳染病之一，種禽場主要通過垂直傳播感染雞沙門氏菌，導(dǎo)致種雞場雞群的生產(chǎn)性能下降，種蛋污染并被逐代放大[12]。在不同地區(qū)和不同環(huán)境因素作用下，養(yǎng)禽場雞沙門氏菌病的陽性率存在一定差異。王政等研究表明，惠州地區(qū)不同縣(區(qū))養(yǎng)禽場沙門氏菌病的抗體平均陽性率為8.30%，種禽場陽性率為5.17%[13]。林晴等研究顯示，福州地區(qū)種禽場的抗體平均陽性率為17.89%[14]。廣東部分地區(qū)種雞群雞白痢平均陽性率為40.6%[15]。本研究對新疆米泉某雞場沙門氏菌病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血清抗體陽性率為19.6%(105/537)，高于惠州和福州等地，可能影響了該雞場雞群的生產(chǎn)性能。近10年來，這是首次報道新疆種禽場沙門氏菌病血清學(xué)的流行情況，為我國禽沙門氏菌病血清學(xué)調(diào)查提供了數(shù)據(jù)資料。

測定家禽中沙門氏菌血清型的多樣性，有助于獸醫(yī)和公共衛(wèi)生當(dāng)局制定預(yù)防戰(zhàn)略，控制家禽中的沙門氏菌病，降低經(jīng)濟(jì)損失，有助于阻止這些血清型向人類傳播[16]。本研究血清學(xué)檢測所用的沙門菌抗原為雞白痢雞傷寒多價染色抗原，但由于雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌都屬于D血清群，具有相同的O抗原，為了明確其生物型，本研究借助PCR手段進(jìn)一步進(jìn)行血清分型，從55只血清抗體呈強(qiáng)陽性的雞肛拭子中，分離得到了3株雞傷寒沙門氏菌。對于抗體陽性而病原陰性的雞只，不排除隱性感染的可能[17]。雞傷寒沙門氏菌是困擾養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性病原之一，受污染的家禽及其產(chǎn)品可引起人的沙門氏菌病，已成為一個公共衛(wèi)生問題[18]，評估家禽中沙門氏菌的分布對于更好地防治沙門氏菌病顯得十分重要[19]。

我國很多地方的種雞場，尤其是小型企業(yè)尚不能通過淘汰措施實現(xiàn)凈化防控，原因是凈化難度大，操作周期長，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。為降低雞沙門氏菌病的危害，大多數(shù)種雞場選擇依靠抗菌藥物，長期用藥，甚至不規(guī)范用藥使得禽沙門氏菌的耐藥性不斷增強(qiáng)[20]。近年來，我國各地禽源沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重，多重耐藥菌株也不斷增加。沈?qū)W懷等報道，在安徽地區(qū)種禽場中多重耐藥的禽源沙門氏菌占比97.62%[21]。陸彥等報道，山東省種禽場沙門氏菌的多重耐藥率為91.0%[22]。本研究中，雞傷寒沙門氏菌分離株XJMQ-S39表現(xiàn)為多重耐藥，并對常用的四環(huán)素、氨芐西林、鏈霉素等抗菌素耐藥，這與Alam報道的養(yǎng)禽場中多重耐藥沙門氏菌的耐藥情況一致[23]。值得注意的是，本研究中3株雞傷寒沙門氏菌都對多黏菌素B呈中度耐藥。多黏菌素是一種對革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)大抗菌作用的環(huán)狀多肽類抗生素，很可能成為未來治療多重耐藥菌感染的最佳選擇[24]，所以在實踐生產(chǎn)中必須謹(jǐn)慎使用。

由于禽沙門氏菌病嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)雞業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。所以，本試驗通過平板凝集試驗、沙門氏菌的分離鑒定以及耐藥性檢測，明確新疆米泉某雞場沙門氏菌病的流行情況。禽沙門氏菌已出現(xiàn)多重耐藥表型，建議慎用耐藥率高的抗菌藥物，以減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。