楊晨晨，李志強，熊鑫鑫，壽 璽，段明軍，魏 琴，姜 濤*

(1.無錫太湖學院護理學院基礎醫(yī)學教研室，江蘇無錫 214600；2.新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院影像中心，烏魯木齊 830011)

泡型包蟲病(Alevolar echinococcosis，AE)和囊型包蟲病(Cystic echinococcosis，CE)是嚴重的人畜共患寄生蟲病，由多房棘球絳蟲(Echinococcusmulticocularis,EM)的幼蟲(泡球蚴)寄生于人體所致[1-2]，其廣泛分布于北半球，中間宿主為嚙齒動物，犬科動物為終末宿主，AE和CE是兩種完全不同的疾病，具有不同生命周期和不同地理分布，AE尤其在中國分布居多[3]。AE是一種破壞性疾病，主要影響肝臟，如不及時治療，會有惡性腫瘤樣發(fā)展和致命的后果[4-5]。泡球蚴病幾乎原發(fā)于肝臟，寄生后的泡球蚴可發(fā)展為一個個相連的囊泡，囊泡浸潤至肝實質，會形成由組織細胞或淋巴細胞形成的壞死帶，直接侵犯并取代正常肝組織[6]。由于90%以上的泡球蚴都寄生在肝臟，研究泡球蚴引起的肝臟損傷特點、肝纖維化特征，可為研究泡球蚴感染機制奠定基礎。有研究顯示，MAPK信號轉導通路參與泡球蚴感染所致肝臟病理損傷過程[7-8]。為了研究泡球蚴感染對肝臟的損傷作用及MAPK信號轉導途徑參與泡球蚴感染所致宿主肝臟病理損傷的過程，本研究擬采用新疆株和青海株的泡球蚴腹腔感染小鼠，觀察不同來源地泡球蚴感染小鼠后肝臟損傷的特點和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Balb/c小鼠，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心；沙鼠，新疆醫(yī)科大學動物實驗中心自繁殖。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0001，

1.1.2 主要試劑 二甲苯、無水乙醇，福晨化學試劑有限公司產(chǎn)品；α-SMA抗體(貨號ab18460)，美國Abcam公司產(chǎn)品；ERK1/2抗體(貨號4695T)、P38MAPK抗體(貨號8690T)，美國CST公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品；4%多聚甲醛通用型組織固定液(biosharp，白鯊物)、Masson三色染色試劑盒、1×PBS(pH7.2-7.4)，北京索萊寶生物技術有限公司產(chǎn)品；Trizol試劑，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒、反轉錄試劑盒，德國Roch公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 手術器械，上海醫(yī)療器械集團有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機(RM2235)，德國Leica公司產(chǎn)品；高速離心機(5424)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(IX71)，日本Olympus公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(IQ5)，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 沙鼠用于傳代，Balb/c小鼠用于制作動物模型，8周齡，雌雄不限，SPF級，體重18 g～22 g。將Balb/c小鼠分為3個組，對照組(10只)、EM-1組(青海株)、EM-2組(新疆株)。EM-1組、EM-2組統(tǒng)稱為造模組，每組10只小鼠，感染期為6個月。動物使用許可證號為SYXK(新)2018-0003，倫理審批號為IACUC20170706-01。

1.2.2 新疆及青海來源地的泡球蚴動物模型的制備 麻醉新疆、青海來源地的長爪沙鼠種鼠，然后將其斷頸處死，在無菌條件下解剖，取出完整的組織團塊，置于含抗生素鹽水的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿移至生物安全柜內(nèi)，剔除組織塊表面的組織，用PBS清洗泡狀組織塊3～5遍，然后經(jīng)勻漿器研磨，再用濾篩過濾，收集過濾液于無菌離心管中，靜置5 min，棄上清后用PBS洗滌原頭節(jié)多次至澄清，肉眼觀察原頭節(jié)呈白色細沙樣均勻顆粒。用生理鹽水制成泡狀棘球蚴原頭節(jié)混懸液，按2 000個/只/mL經(jīng)腹腔注射接種于Balb/c小鼠以制備泡球蚴動物模型，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，于6個月采集全血，采集肝臟組織。

1.2.3 肝臟標本HE染色 6個月后，麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死對照組、EM-1組、EM-2組小鼠，取肝臟組織，將一半肝臟組織置于40 g/L多聚甲醛48 h，石蠟包埋，3 μm切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色；另一半肝臟組織保存于液氮，置-80℃冰箱保存。

1.2.4 肝臟標本Masson染色 石蠟切片脫蠟至水，根據(jù)Masson染色試劑盒說明書進行操作，用顯微鏡觀察肝臟纖維化染色結果，膠原纖維、軟骨呈藍色，胞漿、肌肉、纖維素呈紅色，胞核呈藍色。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測各組小鼠肝臟組織中α-SMA、ERK1/2、P38MAPK的表達 采用免疫組織化學S-P法檢測各組小鼠肝臟組織中α-SMA、ERK1/2、P38MAPK的表達，α-SMA、ERK1/2、P38MAPK的一抗?jié)舛确謩e為1∶200、1∶200和1∶100，DAB顯色，中性樹膠封片，200倍光鏡下每片隨機選取不同的5個視野，采集圖像，用每張染色片中陽性區(qū)域占每張片子的面積的百分比，計算和比較各指標的相對表達量。

1.2.6 熒光定量RT-PCR檢測肝臟組織中α-SMA、ERK1/2、P38MAPK指標的mRNA表達水平 取出對照組及EM-1組、EM-2組小鼠肝臟組織100 mg，將肝組織在液氮中研磨，加入Trizol提取總RNA，測定OD260/OD280值，并記錄濃度(OD260/OD280值在1.8～2.0)，采用反轉錄試劑盒在PCR中反轉錄，反應條件為：42℃ 60 min；70℃ 5 min，4℃中止反應，置-20℃保存?zhèn)溆?。? 000 ng的cDNA與Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)進行熒光定量RT-PCR?！鰿t(N)=目的基因CT(n)均數(shù)-參照基因CT(n)均數(shù)；△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)；然后算出2-△△CT。以β-actin為內(nèi)參。各基因的上下游引物序列見表1。

表1 各基因的引物

2 結果

2.1 各組小鼠感染情況分析

對照組沒有發(fā)生死亡，EM-1組小鼠有1只死亡，EM-2組小鼠有2只死亡，6個月后，解剖小鼠，對照組小鼠肝臟無異常，顏色鮮紅，呈紅棕色，肝臟質地柔軟，EM-1組、EM-2組小鼠肝臟表面可見明顯的大小不一的囊泡，包囊一般呈半透明狀，肝臟表面可肉眼觀察到黃灰色的壞死灶。3組小鼠肝臟病灶大體觀察見圖1。

2.2 3組小鼠肝臟HE染色結果

正常組肝臟組織表現(xiàn)為正常的肝小葉結構，分界明顯，肝細胞核大而居中，異染色質少而著色淺，能看到核仁，肝細胞胞漿豐富，嗜酸性，胞質內(nèi)可見嗜堿性物質。EM-1組、EM-2組小鼠可以觀察到肝細胞點狀壞死，有的肝臟已看不到正常的肝小葉結構細胞排列，匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤，如淋巴細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞，有的組織切片可以觀察到生發(fā)結構，周圍存在慢性炎癥細胞浸潤，周圍還有肉芽腫形成。3組小鼠肝臟HE染色結果見圖2。

A.對照組；B.EM-1組；C.EM-2組A.Control group；B.EM-1 group; C.EM-2 group

A1.對照組; B1.EM-1感染的Balb/c小鼠模型；C1.EM-2感染的Balb/c小鼠模型A2.對照組; B2.EM-1感染的Balb/c小鼠模型；C2.EM-2感染的Balb/c小鼠模型A1.Control group; B1.EM-1 infected Balb/c mouse model; C1.EM-2 infected Balb/c mouse modelA2.Control group; B2.EM-1 infected Balb/c mouse model; C2.EM-2 infected Balb/c mouse model

2.3 3組肝臟Masson染色

對照組見少量網(wǎng)狀纖維，膠原纖維稀疏，見于匯管區(qū)和中央靜脈管壁，EM-1組、EM-2組匯管區(qū)網(wǎng)狀纖維及膠原纖維增生，纖維條索較粗、間隔變寬，部分形成假小葉，中央靜脈周圍纖維化，膠原纖維束向小葉內(nèi)延伸。3組小鼠肝臟Masson染色結果見圖3。

2.4 α-SMA、ERK1/2、P38MAPK在小鼠肝臟組織中的表達

對照組α-SMA、ERK1/2、P38MAPK均呈陰性表達，EM-1、EM-2組α-SMA、ERK1/2表達陽性，P38MAPK呈陰性表達。2組在肝組織增生匯管區(qū)、中央靜脈的周圍有陽性表達的棕色顆粒，見圖3。α-SMA、ERK1/2、P38MAPK在小鼠肝臟組織中的陽性表達率見表2。3組間各指標經(jīng)單因素方差分析，α-SMA、ERK1/2陽性表達面積百分比差異顯著(P<0.05)，各組間P38MAPK陽性面積比無顯著差異(P>0.05)。EM-1、EM-2組α-SMA、ERK1/2陽性表達面積百分比顯著高于對照(P<0.05)。EM-1、EM-2組-SMA、ERK1/2陽性表達面積百分比差異不顯著(P>0.05)。

表2 α-SMA、ERK1/2、P38MAPK在小鼠肝臟組織中的陽性表達面積百分比Table 2 The percentage of positive expression areas of α-SMA,ERK1/2 and P38MAPK in mouse liver tissues

2.5 α-SMA、ERK1/2、P38MAPK mRNA的表達水平

采用2-△△CT方法計算各組小鼠中肝臟α-SMA、ERK1/2 mRNA相對表達量。3組間各指標經(jīng)單因素方差分析，α-SMA、ERK1/2 mRNA的相對表達量差異顯著(P<0.05)，P38MAPK mRNA表達水平差異不顯著(P>0.05)。EM-1、EM-2組α-SMA、ERK1/2 mRNA高于對照組(P<0.05)。EM-1、EM-2組-SMA、ERK1/2 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05，見圖5。

A1.對照組; B1.EM-1感染的Balb/c小鼠模型；C1.EM-2感染的Balb/c小鼠模型A2.對照組; B2.EM-1感染的Balb/c小鼠模型；C2.EM-2感染的Balb/c小鼠模型 A1.Control group; B1.EM-1 infected Balb/c mouse model; C1.EM-2 infected Balb/c mouse modelA2.Control group; B2.EM-1 infected Balb/c mouse model; C2.EM-2 infected Balb/c mouse model

A1．對照組α-SMA表達;A2.EM-1組α-SMA表達; A3.EM-2組α-SMA表達;B1.對照組ERK1/2表達;B2.EM-1組ERK1/2表達;B3.EM-2組ERK1/2表達;C1.對照組P38MAPK表達; C2.EM-1組P38MAPK表達; C3.EM-2組P38MAPK表達A1．Expression of α-SMA in control group;A2.Expression of α-SMA in EM-1 group; A3.Expression of α-SMA in EM-2 group;B1.Expression of ERK1/2 in control group;B2.Expression of ERK1/2 in EM-1 group; B3.Expression of ERK1/2 in EM-2 group;C1.Expression of P38MAPK in control group;C2.Expression of P38MAPK in EM-1 group; C3.Expression of P38MAPK in EM-2 group

3 討論

多房棘球絳蟲形態(tài)和生活史均與細粒棘球絳蟲相似，但成蟲主要寄生在狐，中間宿主是嚙齒類或食蟲類動物，幼蟲期是多房棘球蚴(亦稱泡球蚴)。終宿主主要是狐，其次是犬、狼、獾和貓等。在多房棘球絳蟲寄生的終宿主體內(nèi)，可同時有細粒棘球絳蟲寄生，中間宿主為野生嚙齒類動物，有40多種小型哺乳動物(嚙齒類動物和鼠兔)是已知的中間宿主，如田鼠、倉鼠、小沙鼠、長爪沙鼠等。當體內(nèi)帶有泡球蚴的鼠或動物臟器被狐、犬和狼等終宿主吞食后。約經(jīng)45 d，原頭蚴可以發(fā)育為成蟲并排出孕節(jié)和蟲卵。宿主誤食蟲卵，蟲卵經(jīng)消化液作用后六鉤蚴脫殼而出，經(jīng)腸系膜靜脈進入血液循環(huán)到達肝臟并寄生于此。成蟲寄生在終宿主小腸，孕節(jié)及蟲卵隨糞便排出，鼠類因覓食終宿主糞便而受感染，人因誤食蟲卵而感染。根據(jù)研究分析，我國西部七省區(qū)(新疆、青海、四川、寧夏、甘肅、西藏、內(nèi)蒙古)為高流行區(qū)[9]，泡球蚴在我國的牧民聚集區(qū)仍不能得到有效控制，早期AE臨床癥狀及體征不明顯，因此診斷缺乏特異性，發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于中晚期，病灶已逐漸侵及肝臟各部，對大部分農(nóng)牧地區(qū)的居民身體健康帶來嚴重危害[10]。西藏自治區(qū)農(nóng)牧廳對西藏22個縣的牛、羊棘球蚴流行病學調(diào)查結果顯示，牛、羊棘球蚴平均感染率為13.06%和44.72%[11]。陽愛國等[12]2016年對四川省家畜包蟲病的流行情況調(diào)查顯示，甘孜州牛、羊包蟲病感染分別為12.21%和11.30%。提示泡球蚴屬地不同，其對人類及家畜的感染率也有很大差異，這是一個值得探究的問題，以便針對不同屬地的泡球蚴對癥治療。本研究對兩種不同來源地的泡球蚴致肝損傷特點及病理損傷的機制進行了研究，可為不同來源地的泡型包蟲病臨床治療提供思路。

通過對小鼠肝臟HE及Masson染色結果分析，泡球蚴對小鼠肝臟有損傷，肝組織發(fā)生壞死，匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤，肝小葉結構可觀察到病灶邊緣帶區(qū)域和壞死區(qū)。Masson染色也可觀察到纖維化病灶邊緣帶肝組織膠原染色增多，膠原纖維呈致密環(huán)狀結構，圍繞囊壁周圍廣泛分布。肝纖維化是泡型包蟲病主要特征之一，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細胞外基質過度沉積以及肝實質細胞彌漫芽生生長，并逐漸蔓延到整個肝臟，是一個復雜的全身病理生理過程，在肝纖維化過程中，肝星狀細胞會在遇到毒素等外界刺激時被激活，最終分化為肌成纖維細胞。從病理學特征觀察，泡球蚴感染小鼠肝臟發(fā)生了損傷，發(fā)生了一定程度的肝纖維化。

注：與對照組比較，*P<0.05Note:Compared with control group,*P<0.05

α-平滑肌肌動蛋白(alpha-SMA，α-SMA)是位于干細胞和前體細胞中的42 ku的肌動蛋白同工型蛋白。α-SMA是一種眾所周知的特征蛋白，用于評估在包括肺在內(nèi)的多個組織和器官中激活成纖維細胞[13-14]，可以間接反映肝星狀細胞活化的強度，推測肝纖維化的進展[15-16]。本研究通過免疫組織化學染色檢測各組小鼠α-SMA的表達水平。α-SMA在正常小鼠肝臟中呈陰性表達，在EM-1、EM-2組呈陽性表達，采用定量分析發(fā)現(xiàn)，EM-1、EM-2組陽性表達面積百分比高于對照組，但2組間α-SMA的表達量無差異。從mRNA水平也證實了以上結果。提示泡球蚴感染，促進了肝纖維化的進程。肝纖維化病灶越多，泡球蚴對宿主的損傷越重，但是兩種不同來源地的泡球蚴的肝纖維化程度沒有發(fā)現(xiàn)差別，提示對肝臟纖維化的影響沒有區(qū)別。而判斷肝纖維化的指標。不止α-SMA一種，Ⅲ型膠原可作為肝纖維化的標志區(qū)[17-18]，在泡球蚴感染小鼠中，與肝纖維化有關的還有Ⅰ、Ⅲ型膠原。王俊華等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型膠原是引起肝纖維化的主要膠原，陽丹才讓等[20]也發(fā)現(xiàn)泡球蚴病的肝纖維化是由Ⅲ型膠原增多引起的。游志遠[21]也有類似的研究，發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染患者病灶周圍組織主要膠原為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。相關研究表明，骨橋蛋白金屬蛋白抑制因子(TIMP-1)、金屬蛋白酶(MMP-9)在肝包蟲囊壁及周圍組織中高表達[22]。肝纖維化進程受多種因子影響和通路的調(diào)控，本研究只是對肝纖維化的一種指標α-SMA進行研究，后期應繼續(xù)開展肝包蟲其它肝纖維化指標的相關研究。

泡狀棘球蚴等多種寄生蟲疾病發(fā)生都與MAPK信號通路有關，通過MAPK信號轉導通路，促進多房棘球蚴細胞間信息交流，從而影響其生長和發(fā)育[23]。MAPK信號轉導途徑是將細胞外刺激信號傳至細胞核進而介導細胞信息傳遞的共同通路。在肝損傷以及感染、炎癥狀態(tài)下，TGF-β1介導MAPK信號轉導途徑參與肝細胞生長、增殖、存活、凋亡等反應[24]。研究表明，ERK1/2是受外界刺激時決定細胞命運的關鍵性因素和關鍵位點，激活的ERK1/2由胞質轉位到核內(nèi)，激活核內(nèi)轉錄因子(Elk-1，ATF，NF-κB，Ap-1，c-fos和c-Jun等)，這些轉錄因子進一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉錄，參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)維持和細胞存活等多種生物學反應。P38MAPK是一類胞內(nèi)信號轉導蛋白，有研究表明其在棘球幼感染的肝旁組織表達增高。而P38MAPK在肝臟炎癥以及氧化應激的過程中都起著重要作用，且有相關研究表明，P38MAPK可明顯促進smad2蛋白的磷酸化，另外P38MAPK可作為TGF-β1的信號通路蛋白而發(fā)揮氧化應激作用，進一步刺激肝細胞的活化增殖形成纖維化[25]?？梢娫诟伟x病纖維化的發(fā)展中P38MAPK發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及免疫組織化學(immunochemistry)的方法，對感染泡球蚴的小鼠及對照組小鼠肝臟組織中的ERK1/2和P38MAPK的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，EM-1組和EM-2組小鼠肝臟組織中的ERK1/2蛋白和mRNA表達水平明顯升高，而P38MAPK的表達在3組中無明顯差異，EM-1組和EM-2組與對照組比較未發(fā)現(xiàn)有差異。紀靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，感染組小鼠肝臟組織中ERK1/2表達水平顯著升高，P38MAPK表達兩組沒有差異，本研究與之報道一致。而李振偉等[27]觀察20例經(jīng)手術診斷為AE的肝纖維化患者，觀察P38MAPK蛋白在人肝正常肝組織及病變組織P38MAPK表達水平或整個肝組織均與纖維化程度呈正相關，P38MAPK的表達水平隨纖維化程度的增加而增加。研究結果的不一致，可能與感染物種、劑量和時間不同有關，后續(xù)還需要進一步驗證。

本研究所選用的泡球蚴來自不同源地，我們發(fā)現(xiàn)新疆株和青海株對α-SMA、ERK1/2、P38MAPK表達的影響沒有差異，提示其對肝臟纖維化和MAPK調(diào)控作用是相似的。

綜上所述，本試驗通過腹腔注射新疆株、青海株不同來源的泡球蚴，觀察小鼠肝組織形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)生了病理性損傷，伴有大量膠原纖維化的標志物α-SMA陽性表達，同時發(fā)現(xiàn)泡球蚴激活了MAPK信號轉導途徑，引起ERK1/2活化，促進細胞增殖，其對肝細胞生長、增殖、活化的影響，還有待于進一步研究。