張小波，馮 鵬，趙 欽，

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是豬的一種急性的高度接觸性傳染病，此病因?qū)е仑i耳朵發(fā)紺，俗稱為“藍耳病”。PRRS自1987年首次報道以來[1]，一直是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。疫苗接種是預防該病的重要手段之一，目前報道，除了傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗，還有新型的核酸疫苗[3]。PRRS的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，PRRSV在流行過程中不斷變異[4-6]，為PRRS的防控帶來了嚴重的挑戰(zhàn)。建立快速診斷PRRSV野毒感染方法對于防控PRRS具有重要意義。

Nsp12為PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白，由153個氨基酸組成，分子質(zhì)量為17 ku，位于ORF1b的末端。Nsp12能夠利用宿主細胞的HSP70來促進病毒的復制[7]，因此，Nsp12是參與PRRSV復制的重要非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。由于Nsp12只在病毒的復制周期表達，因此，Nsp12抗體只能在具有感染性的PRRSV感染豬只中才能被檢測到。研究表明，Nsp12具有保守的B細胞抗原表位[9]，能夠誘導機體產(chǎn)生抗體，可以作為檢測PRRSV野毒感染的指標。因此，本研究采用原核表達系統(tǒng)表達PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp12，利用表達的蛋白包被ELISA板，建立檢測血清中抗Nsp12的抗體的方法，為檢測豬場PRRSV野毒感染情況，凈化PRRS提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 抗PRRSV的陽性血清和陰性血清，由西安市灞橋區(qū)動物疾病預防控制中心獸醫(yī)實驗室保存；92份血清樣品，通過聯(lián)系不同豬場采集獲得，血清樣本采集的豬場均有免疫記錄，且部分血清采集的豬只疑似PRRSV感染。

1.1.2 主要試劑 原核表達載體pET-32a(+)、E.coliDH5α工程菌和E.coliBL21(DE3)工程菌，由西安市灞橋區(qū)動物疾病預防控制中心獸醫(yī)實驗室保存；KoD-Plus高保真酶、用于合成cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；普通rTaq 酶與dNTPs，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，賽默飛世爾科技(中國)有限公司旗下Fermentas產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A?Gel Extraction Kit Ⅰ)和小量質(zhì)粒抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；HisTrap FF crude 1 mL預裝柱，GE公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒，美基(Magen)生物技術(shù)公司產(chǎn)品；抗6×His單克隆抗體與HRP標記羊抗鼠IgG，合達生物公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG，索萊寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PRRS X3檢測試劑盒，IDEXX公司產(chǎn)品；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 酶標儀(Bio-RAD 680)、PCR儀(T100)，美國伯樂(Bio-Rad)公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(NanoDrop2000)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(1600)、化學曝光儀(Tanon6600)，上海天能公司產(chǎn)品；電熱恒溫水槽(DK-8D)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(VD-850)，蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(5418R)，Eppendorf(中國)有限公司產(chǎn)品；電子分析天平(BSA2201)，德國Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增與克隆 根據(jù)NCBI上PRRSV A2MC2毒株Nsp12基因序列(GenBank No.KX462792.1)，設計一對擴增Nsp12的引物：Nsp12-F：5′-cacgaattcggtcgctatttcacctggtatc-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)；Nsp12-R：5′-cccctcgagattcaggcctaaagtt-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

從某豬場采集疑似PRRS病豬胎盤、血清和肺組織等，將采集的組織剪碎，于含有PBS的研缽中利用石英砂進行組織研磨，將研磨液反復凍融3次后，12 000 r/min、4℃離心10 min，收取上清，參照試劑盒說明書，利用HiPure Universal RNA Kits(Magen)試劑盒提取RNA，然后以抽提的RNA為模板，參照東洋紡(上海)生物科技有限公司的高效逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒ReverTra Ace的說明書進行cDNA第一鏈的合成，合成引物為隨機引物。

以合成的cDNA為模板，利用KoD-Plus高保真酶通過PCR擴增Nsp12基因，使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a(+)，分別回收目的片段和載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，使用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定。經(jīng)雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pET32-Nsp12。

1.2.2 目的基因的表達、純化與鑒定 將重組質(zhì)粒pET32-Nsp12和空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，挑取陽性菌于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導Nsp12的表達，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取出菌液進行SDS-PAGE分析。然后進行IPTG濃度和誘導時間的優(yōu)化，確定Nsp12表達的最佳誘導條件。按照最佳誘導條件，將誘導表達的菌液離心，收集菌體超聲裂解，離心后分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，確定Nsp12蛋白的主要表達形式。將表達的Nsp12蛋白使用HisTrap FF親和層析柱進行蛋白純化，純化后的Nsp12利用His-Tag標簽抗體和抗PRRSV的陽性血清進行Western blot，蛋白Marker和免疫印跡分別通過天能ECL化學發(fā)光儀的白光拍攝和曝光拍攝，然后分析鑒定重組Nsp12蛋白。

1.2.3 基于Nsp12蛋白的檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法的建立 使用Thermo Fisher公司的Nanodrop 2000微量分光光度計測定純化的Nsp12重組蛋白濃度，用PBS稀釋的Nsp12重組蛋白進行包被，4℃過夜；用100 mL/L FBS進行封閉，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次；分別加入1∶50稀釋的PRRSV陰性和陽性血清，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次；加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次；然后加入底物液TMB，室溫避光反應10 min；用2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測定OD450值。通過棋盤法優(yōu)化抗原包被濃度和血清稀釋度、封閉液種類和稀釋度、血清反應時間和溫度，建立檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法?？乖粷舛确謩e稀釋為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、16.0 mg/L共6個梯度；血清作1∶1、1∶5、1∶25和1∶125稀釋；封閉液種類和稀釋度為：10、30、50 g/L BSA，50、100 mL/L FBS，10、30、50 g/L脫脂奶粉；血清反應時間分別設置30、60、90、120 min；溫度選擇25℃(室溫)和37℃。

1.2.4 Nsp12-ELISA方法陰陽性臨界值判定實驗 按照上述確定的最優(yōu)條件建立的檢測Nsp12抗體的間接ELISA方法檢測30份PRRSV陰性豬血清，依據(jù)公式：臨界值=陰性對照OD450 nm (平均值)+3×標準方差(SD)確定檢測方法的臨界值。

1.2.5 與IDEXX試劑盒比較 收集臨床血清樣品92份，利用IDEXX的試劑盒檢測(PRRS X3)和建立的間接ELISA方法進行PRRSV抗體檢測。 將檢測結(jié)果進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET32-Nsp12的構(gòu)建和鑒定

通過RT-PCR從PRRSV疑似樣本中擴增得到Nsp12基因(圖1)。將Nsp12基因通過酶切連接克隆至pET-32a(+)原核表達載體，使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET32-Nsp12(圖2)，將雙酶切鑒定陽性的質(zhì)粒進行測序，將測定序列在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)擴增得到的Nsp12基因與近幾年流行的PRRSV PRR71566-S9-L001、SD95-21、RVRp22和YN-2011等毒株的Nsp12基因完全匹配；與PRRSV A2MC2毒株的Nsp12序列進行比對，只有403位點的G突變?yōu)锳。以上結(jié)果表明，原核表達Nsp12重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標準DL 2 000；1.Nsp12基因PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M1.DNA標準DL 15 000；M2.DNA標準DL 2 000；1.pET32-Nsp12質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 Nsp12基因的誘導表達與鑒定

將重組質(zhì)粒pET32-Nsp12轉(zhuǎn)化至原核表達宿主菌E.coliBL21(DE3)(含融合蛋白和標簽蛋白)，使用IPTG誘導細菌表達Nsp12重組蛋白，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在預期大小位置40 ku處有明顯的蛋白條帶，而轉(zhuǎn)化的空載體pET-32a(+)的樣品沒有，確證Nsp12蛋白獲得表達(圖3)。通過對表達條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示，最佳的IPTG濃度為0.5 mmol/L，最佳誘導溫度為37℃。按照最佳誘導條件，誘導細菌表達Nsp12重組蛋白，收集菌體進行超聲破碎，離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的蛋白主要存在于沉淀中，表明Nsp12重組蛋白以包涵體的形式表達。使用尿素溶解包涵體后，利用鎳柱進行親和層析純化并收集純化的Nsp12蛋白，利用His-tag單抗和PRRSV陽性血清通過Western blot對純化的蛋白進行鑒定，結(jié)果顯示，表達的重組蛋白能夠被His-tag單抗識別(圖4)，且表達的Nsp12蛋白能夠與PRRSV陽性血清發(fā)生特異性反應(圖5)。表明獲得的Nsp12蛋白具有良好的反應原性。

M.蛋白標準；1.未經(jīng)IPTG誘導的pET32-Nsp12；2.經(jīng)IPTG誘導的pET-32a(+)空載體對照；3.經(jīng)IPTG誘導表達的pET32-Nsp12

M.蛋白標準；1.IPTG誘導空載體對照；2.IPTG誘導的表達產(chǎn)物；3.未經(jīng)IPTG誘導的pET32-Nsp12

2.3 檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法的建立及陰陽性臨界值確定

使用純化的重組Nsp12蛋白作為抗原建立檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法。通過對建立的ELISA方法的優(yōu)化，確定了Nsp12蛋白的最佳包被濃度為4.0 mg/L，最佳血清稀釋度為1∶25，最佳封閉液為50 g/L的BSA，血清的最佳反應溫度為37℃，最佳反應時間為60 min。按照優(yōu)化的條件建立檢測Nsp12抗體的間接ELISA方法，利用此方法檢測本單位實驗室保存的30份PRRS陰性血清(由IDEXX試劑盒檢測確證)，計算出陰性血清的OD450 nm的平均值為0.098，SD=0.043，因此，確定陰陽性臨界值為OD450nm 0.227。

M.蛋白標準；1.IPTG誘導的表達產(chǎn)物；2.IPTG誘導空載體對照；3.未經(jīng)IPTG誘導的pET32-Nsp12

2.4 Nsp12間接ELISA與IDEXX試劑盒的比對

收集不同豬場的92份臨床血清樣品(所有豬場均有免疫PRRS疫苗記錄，且部分樣品采集的豬只疑似感染PRRSV)。同時使用IDEXX的試劑盒和本研究建立的間接ELISA對92份血清樣品進行檢測。IDEXX試劑盒檢測結(jié)果顯示，有87份血清檢測結(jié)果陽性，5份為陰性；Nsp12 間接ELISA檢測結(jié)果顯示，有32份為陽性，60份為陰性，陽性符合率為36.78%(32/87)，陰性的符合率為100%(5/5)，有55份樣品和IDEXX的檢測結(jié)果不一致(59.78%不符合率)。此外，Nsp12 間接ELISA檢測的32份陽性均為IDEXX檢測的高陽性樣本。

3 討論

目前PRRS依然是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，通過血清學監(jiān)測可以有效凈化陽性豬場。監(jiān)測PRRSV抗體的主流手段為IDEXX的ELISA試劑盒，抗體檢測精確度較高，但是無法有效區(qū)分野毒和疫苗誘導產(chǎn)生的抗體。因此，篩選合適的檢測PRRSV野毒抗體的抗原一直是PRRSV血清學研究的一個重要方向。Nsp12蛋白作為非結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒的復制發(fā)揮多種功能[10-12]，且能夠誘導抗體產(chǎn)生，能夠作為檢測PRRSV野毒抗體的理想抗原。本研究選用原核表達系統(tǒng)對Nsp12蛋白進行表達，其優(yōu)點是蛋白表達量較高，成本低，且表達的Nsp12的反應原性較好，對于后續(xù)建立檢測方法沒有影響。ELISA檢測血清抗體具有高通量、敏感性高、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于抗體水平的檢測。本研究利用PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白建立的間接ELISA方法主要用于檢測PRRSV活毒感染誘導產(chǎn)生的抗體水平，因此，如果豬場使用的滅活PRRSV疫苗對豬進行免疫，則無法檢測疫苗誘導產(chǎn)生的抗體水平。通過與IDEXX試劑盒的對比分析發(fā)現(xiàn)，本研究建立的檢測PRRSV抗體的ELISA方法與其符合率并不是太高，兩種方法檢測結(jié)果中陽性血清份數(shù)差異很大，其原因可能是IDEXX的試劑盒可以檢測到疫苗誘導產(chǎn)生的抗體，而本研究建立的間接ELISA方法只能檢測到活PRRSV感染誘導產(chǎn)生的抗體。因此，本研究建立的ELISA檢測陽性率遠遠不如IDEXX的試劑盒。但是本研究建立的ELISA方法檢測的陽性血清均是IDEXX檢測出的超高陽性的血清，這也從側(cè)面說明了本研究建立的ELISA可能檢測到的是活毒PRRSV感染的抗體。對于陰性血清，則是100%的符合，說明本研究建立的ELISA方法對陰性血清不會產(chǎn)生假陽性?？偟膩碚f，本研究建立的ELISA方法對于檢測PRRSV活毒感染誘導產(chǎn)生的抗體具有一定的應用價值，可為檢測豬場PRRSV感染提供工具。