蘇畫畫，黃瑞瑞，劉 敏，王博延，張?zhí)鞂?，柴學(xué)軍，徐 曦

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710021)

糖皮質(zhì)激素是一類具有神經(jīng)活性的甾體類激素，在新生鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段，糖皮質(zhì)激素可引起腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的減少[1]。大劑量多療程的糖皮質(zhì)激素應(yīng)用可引起體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元炎癥小體增加，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2]。由于妊娠晚期正是胚胎大腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，母親接受糖皮質(zhì)激素治療的新生兒精神和行為障礙風險顯著增加[3]。目前，糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用是如何引起胚胎大腦發(fā)育異常的報道卻很少。

搖晃蛋白(Reelin)是一種大分子糖蛋白，胚胎發(fā)育期間主要由大腦皮質(zhì)邊緣區(qū)(Marginal Zone,MZ)的Cajal-Retzius(CR)細胞分泌，其對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元遷移起著重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)的室區(qū)出生，然后沿著放射狀膠質(zhì)細胞纖維向MZ遷移，最終以“由內(nèi)向外”的方式形成大腦皮層的六層結(jié)構(gòu)，即早出生的神經(jīng)元定位于大腦皮質(zhì)深部，晚出生的神經(jīng)元定位于大腦皮質(zhì)表層。Reelin通過與遷移神經(jīng)元膜表面的受體結(jié)合，穩(wěn)定細胞骨架，促進神經(jīng)元向著Reelin陽性的MZ遷移[4]。當神經(jīng)元胞體接觸到Reelin陽性的MZ時，遷移停止。因此，Reelin既被認為是一種吸引信號，又被證明是一種終止信號[5]。缺乏Reelin的小鼠，大腦皮層六層結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)，邊緣區(qū)充滿神經(jīng)細胞[5]。給孕鼠注射生胃酮可促進母體將糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)給胚胎，引起仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin蛋白、Reelin受體VLDLR以及適配器Dab1蛋白表達下降[6]。說明糖皮質(zhì)激素增加可導(dǎo)致仔鼠Reelin信號減弱。但孕鼠糖皮質(zhì)激素的直接應(yīng)用是否引起仔鼠Reelin信號的改變以及神經(jīng)元遷移障礙，尚無明確報道。地塞米松(dexamethasone，簡稱Dxms)是一種人工合成的糖皮質(zhì)類激素，可通過血腦屏障和胎盤屏障，本文通過建立母鼠孕晚期地塞米松暴露模型，研究地塞米松對仔鼠大腦皮質(zhì)中Reelin表達以及神經(jīng)元遷移的影響，闡明地塞米松對胚胎大腦皮質(zhì)發(fā)育作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院陜西省重點腦疾病研究所鼠房，室溫18℃～23℃，濕度50%～60% ，保持每日12 h燈照與12 h黑暗交替。選擇健康2～3月齡昆明雌鼠12只(體重30 g～35 g)，雄鼠4只(體重35 g～40 g)，按照3∶1雌雄比，于下午6:00同籠，次日晨查陰栓(陰道處乳白色、固態(tài)膠狀物)，查有陰栓者分籠飼養(yǎng)，并記為妊娠第0.5天(E0.5)。所有試驗操作均符合西安醫(yī)學(xué)院實驗動物管理辦法。

1.1.2 主要試劑 地塞米松磷酸鈉注射液，中國辰欣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；多聚甲醛，中國國藥集團化學(xué)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖(Agarose)，美國Biowest公司產(chǎn)品；正常山羊血清，Triton X-100， SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，5×蛋白上樣緩沖液，三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 氨基乙酸(Glycine)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，Tris-HCl，氯化鈉(NaCl)，吐溫T-20，均為美國Solarbio公司產(chǎn)品；多克隆山羊抗Brn2一抗，多克隆兔抗β-actin一抗，山羊抗小鼠或兔共軛辣根過氧化物酶HRP的二抗，均為美國Abcam公司產(chǎn)品；多克隆小鼠抗Reelin一抗(G10)，驢抗山羊共軛的IgG Alexa-488，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑，組織RIPA裂解液，均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；防熒光淬滅封片劑(Fluromount-G)，美國Southern Biotech公司產(chǎn)品；BCA蛋白檢測試劑盒，美國Pierce公司產(chǎn)品；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，牛血清白蛋白(BSA),化學(xué)發(fā)光液PierceTMECL Western Blotting substrate，均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 振蕩切片機(VT1000S)，德國Leica公司產(chǎn)品；體視顯微鏡(Stemi 508)、共聚焦顯微鏡(SP8)，德國Leica公司產(chǎn)品；凝膠電泳與成像儀(ChemiDocTMTouch Imaging System),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與地塞米松用藥 母鼠于妊娠第14.5天(E14.5)隨機分為2組，各6只。試驗組，于E14.5～E18.5，每天上午9:00～10:00腹腔注射0.4 mg/kg地塞米松磷酸鈉注射液；對照組，注射等劑量生理鹽水，其他同試驗組。

1.2.2 腦組織固定及切片 試驗組與對照組仔鼠于出生當天(P0)分別取6只仔鼠斷頭取腦，稱重，用40 g/L多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，之后置于0.1 mol/L磷酸緩沖液 (Phosphate buffer,PB，pH7.4) 12 h漂洗；經(jīng)40 g/L瓊脂糖包埋后，用振蕩切片機將小鼠大腦作冠狀切片，厚度為50 μm。

1.2.3 免疫熒光染色 切片用0.1 mol/L PB洗3次，每次15 min，之后用含50 mL/L正常山羊血清，2 g/L Triton X-100 的0.1 mol/L PB(pH7.4)封閉液室溫孵育30 min，封閉非特異性抗原；封閉液加多克隆山羊抗Brn2一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜；次日，回收一抗，切片用0.1 mol/L PB洗3次，每次15 min；在驢抗山羊共軛的Alexa-488(1∶300)二抗里室溫下孵育2 h；0.1 mol/L PB洗3次，每次15 min，用PI染細胞核30 min；0.1 mol/L PB洗3遍，防熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.4 大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)提取 實驗組與對照組于P4各取4只仔鼠斷頭取腦，在體視顯微鏡下分離大腦皮質(zhì)，按1 mL/g加入含10 g/L蛋白酶抑制劑和10 g/L磷酸酶抑制劑的組織裂解液RIPA，液氮快速冷凍，機械研磨，使組織徹底分解，4℃ 、13 000 r/min離心30 min。吸取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒測蛋白質(zhì)濃度后，立即用于Western blot檢測或儲存于-80℃。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(Western blot) 按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明書配方制膠(80 g/L的分離膠，50 g/L濃縮膠)備用。配制上樣液：每20 μg蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×，終體積用純水稀釋為20 μL。上樣液于金屬浴中95℃煮5 min，取出后立即放冰上。蛋白樣品經(jīng)1×跑膠液(250 mmol/L Tris,1.9 mol/L Glycine,10 g/L SDS,加純水至1 000 mL配成10×，pH8.6,稀釋10倍為1×使用),用1×轉(zhuǎn)膜液(181.5 mmol/L Tris,1.48 mol/L Glycine，加純水至1 000 mL配成10×，再取100 mL加入200 mL甲醇加純水至1 000 mL配成1×使用，pH8.3)。電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉液為含50 g/L(w/v) BSA的1×TBST (200 mmol/L Tris-HCl,1.5 mol/L NaCl，加純水至1 000 mL，稀釋10倍為1×TBS，pH7.5。1×TBS中再加入10 g/L吐溫T-20為1×TBST ),室溫封閉膜1 h，一抗加入封閉液(小鼠抗Reelin抗體，1∶1 000；兔抗β-actin抗體,1∶1 000)，4℃孵育過夜。次日漂洗后，膜在室溫下用山羊抗小鼠或兔共軛辣根過氧化物酶HRP的二抗(1∶3 000，用1×TBST稀釋)孵育1 h，用1×TBST洗3遍，1×TBS洗1遍，化學(xué)發(fā)光液PierceTMECL Western blot substrate 與HRP化學(xué)反應(yīng)，凝膠成像儀檢測發(fā)光信號和拍照。

1.2.6 Image J灰度測量 蛋白印跡檢測的蛋白質(zhì)條帶灰度用Image J軟件測量分析 (National Institutes of Health)。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對仔鼠大腦重量的影響

孕鼠于E14.5～E18.5每天腹腔注射0.4 mg/kg地塞米松,基本情況良好，無明顯異常反應(yīng)，仔鼠出生后外觀無明顯異常。取P0仔鼠大腦，稱重，對照組(A)腦重為177.76 mg±3.79 mg，地塞米松組(B)腦重為168.80 mg±4.24 mg。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水注射的對照組相比，孕晚期地塞米松處理引起仔鼠大腦重量減輕，T檢驗結(jié)果如圖1所示，差異極顯著P<0.01，(圖1)。

A.對照組；B.地塞米松處理組 A.Control group;B.Dxms treatment group

2.2 地塞米松對仔鼠大腦皮層神經(jīng)元遷移的影響

為了研究孕晚期地塞米松暴露對仔鼠大腦皮層神經(jīng)元遷移的影響，對E14.5～E18.5孕鼠腹腔注射0.4 mg/kg地塞米松，通過免疫熒光染色法用Brn2抗體標記仔鼠大腦皮層晚期出生的神經(jīng)元，并用激光共聚焦顯微鏡拍照(圖2)，Ⅰ-Ⅵ表示大腦皮層六層結(jié)構(gòu)；Ⅰ為大腦皮層第一層，即大腦皮層邊緣區(qū),主要由Cajal-Retzius細胞組成,這些細胞來自位于脈絡(luò)叢以及將來發(fā)育為海馬的暫時存在的結(jié)構(gòu)組織；Ⅱ-Ⅲ為大腦皮層第二、三層，由最晚出生于大腦皮質(zhì)室區(qū)的神經(jīng)元組成,這些細胞以由內(nèi)向外的方式遷移至此；Ⅳ為大腦皮層第四層，由出生于大腦皮質(zhì)室區(qū)的神經(jīng)元遷移至此組成；Ⅴ/Ⅵ為大腦皮層第五、第六層，由最早出生于大腦皮質(zhì)室區(qū)的神經(jīng)元遷移至此組成(標尺為80 μm)。

圖2 孕晚期地塞米松暴露引起仔鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元遷移障礙(10×)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組(A)P0仔鼠大腦皮質(zhì)中晚期出生的Brn2陽性(綠色)神經(jīng)元都到達了大腦皮質(zhì)的Ⅱ-Ⅲ層，即它們的最終目的地，而且細胞排列緊密；地塞米松組(B)P0仔鼠大腦皮質(zhì)晚期出生的Brn2陽性神經(jīng)元大部分也已到達Ⅱ-Ⅲ層，但與對照組相比，仍有很多細胞沒有到達它們的最終目的地Ⅱ-Ⅲ層，而是聚集在Ⅱ-Ⅲ層下方，致使Brn2陽性細胞帶增厚，但細胞密度稀疏，第Ⅳ層下移(虛線所示范圍)，說明孕晚期地塞米松暴露引起仔鼠大腦皮層神經(jīng)元遷移障礙。

對照組與地塞米松組Brn2陽性細胞帶的厚度測量結(jié)果顯示，對照組(A)Brn2陽性細胞帶的厚度為122.06 μm±5.37 μm，地塞米松組(B)為158.20 μm±9.54 μm；通過T檢驗分析地塞米松組與對照組仔鼠大腦皮質(zhì)Brn2陽性細胞帶的厚度，結(jié)果顯示，地塞米松組較對照組明顯增厚(P<0.001)(圖3)。

A.對照組；B.地塞米松處理組 A.Control group;B.Dxms treatment group

2.3 地塞米松對仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin表達的影響

Reelin全長蛋白分子量約380 ku，分泌出來被基質(zhì)中的金屬蛋白酶剪切成大小不等的片段[6]。母鼠于E14.5～E18.5連續(xù)5 d腹腔注射地塞米松，P4仔鼠大腦皮質(zhì)Western blot結(jié)果顯示，地塞米松組(B)仔鼠大腦皮質(zhì)中Reelin全長蛋白表達較對照組(A)減少。Actin蛋白作為上樣對照(圖4)。

用Image J測量蛋白質(zhì)條帶灰度密度，結(jié)果使用T檢驗的方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯示具有極顯著差異(P<0.01)(圖5)。

A.對照組；B.地塞米松處理組A.Control group;B.Dxms treatment group

A.對照組；B.地塞米松處理組A.Control group;B.Dxms treatment group

3 討論

大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中，新生神經(jīng)元由室區(qū)產(chǎn)生并向大腦皮質(zhì)邊緣帶遷移。邊緣帶緊貼軟腦膜，含有分泌Reelin 的CR細胞。室區(qū)不斷產(chǎn)生的新生神經(jīng)元穿過早出生的神經(jīng)元，向表層遷移，到達Reelin陽性的邊緣帶停下來，形成“由內(nèi)向外”的皮質(zhì)板六層結(jié)構(gòu)，即最早出生的神經(jīng)元定位于皮質(zhì)深處第Ⅵ層，而最晚出生的神經(jīng)元則位于淺層Ⅱ-Ⅲ層[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，Reelin與神經(jīng)細胞膜上的阿樸脂蛋白受體2(APOER2)和極低密度脂蛋白受體(VLDLR)結(jié)合共同調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移。Reelin片段與神經(jīng)元引導(dǎo)纖維上的APOER2結(jié)合，引起細胞內(nèi)SFK家族的Src和Fyn激酶磷酸化，激活胞內(nèi)適配器蛋白Dab1，從而引起肌醇磷脂激酶PI3K磷酸化，導(dǎo)致肌動蛋白解聚蛋白Cofilin磷酸化(p-Cofilin)，使Cofilin失活，穩(wěn)定細胞骨架，使神經(jīng)元在皮質(zhì)板內(nèi)穩(wěn)定遷移[4-5]。當神經(jīng)元到達Reelin陽性的邊緣帶時，Reelin與神經(jīng)元膜上VLDLR結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)元從放射狀膠質(zhì)纖維上脫落，遷移停止[5]。

本試驗給妊娠晚期小鼠注射地塞米松，結(jié)果顯示，仔鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元遷移障礙，本應(yīng)到達最終目的地Ⅱ-Ⅲ層的細胞還在Ⅱ-Ⅲ層的下方。為了探究地塞米松影響神經(jīng)元遷移的機制，研究了給孕鼠注射地塞米松處理是否會影響仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin的表達，因為Reelin是大腦發(fā)育期間調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移的重要分子。通過Western blot檢測結(jié)果顯示，地塞米松組仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin表達明顯下降。說明地塞米松確實通過影響Reelin表達從而影響神經(jīng)元遷移。然而，地塞米松是如何下調(diào)Reelin表達的機制仍然不是很清楚。

在胚胎發(fā)育期間，Reelin主要由邊緣區(qū)的CR細胞合成分泌[4]，出生以后CR細胞逐步凋亡，其分泌的Reelin也逐漸減少。此時，Reelin由大腦皮質(zhì)及海馬的γ氨基丁酸(GABA)中間神經(jīng)元繼續(xù)分泌，穩(wěn)定大腦皮質(zhì)及海馬突觸結(jié)構(gòu)，增強學(xué)習與記憶能力[6]。研究表明，給孕鼠注射糖皮質(zhì)激素引起出生前仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin信號改變，新生鼠空間學(xué)習與記憶障礙；給成年鼠反復(fù)注射糖皮質(zhì)激素，導(dǎo)致成年鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回顆粒下層Reelin陽性細胞顯著減少,神經(jīng)突觸減少[7-10]。所以，孕晚期地塞米松的應(yīng)用可能導(dǎo)致子代大腦皮質(zhì)中Reelin 陽性細胞數(shù)量減少，Reelin表達下降。

糖皮質(zhì)激素主要通過與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結(jié)合發(fā)揮作用。GR屬于核受體超家族，主要位于細胞質(zhì)中，在大腦神經(jīng)元中廣泛分布。糖皮質(zhì)激素為脂溶性激素，能夠透過細胞膜進入細胞質(zhì)結(jié)合并活化GR。GR以同源二聚體形式與DNA特定序列或糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GREs)相互作用，調(diào)控基因表達[11]。因此推測，地塞米松可能使仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin基因表達下降，導(dǎo)致CR細胞分泌Reelin蛋白減少。

地塞米松組的仔鼠大腦重量減輕，表明地塞米松可影響仔鼠的大腦發(fā)育。有文獻證明，地塞米松對體外培養(yǎng)的成年大鼠海馬祖細胞增殖有抑制作用[12]。地塞米松是否引起胚胎神經(jīng)元增生減少尚有待進一步驗證。研究證明，孕晚期母鼠地塞米松的反復(fù)運用可引起仔鼠大腦發(fā)育遲緩，神經(jīng)元遷移調(diào)節(jié)因子Reelin表達下降，神經(jīng)元遷移障礙。這些發(fā)現(xiàn)對于深入研究地塞米松在大腦發(fā)育過程中的作用機理有很大幫助，對指導(dǎo)臨床用藥，防止與發(fā)育相關(guān)的神經(jīng)精神疾病的發(fā)生有著重大的臨床意義。

本研究建立了妊娠晚期地塞米松暴露模型，利用免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，地塞米松引起仔鼠大腦皮層晚期出生的神經(jīng)元遷移障礙；Western blot結(jié)果顯示，地塞米松引起仔鼠大腦皮質(zhì)Reelin蛋白表達下降。這些發(fā)現(xiàn)提示，妊娠期地塞米松暴露對仔鼠大腦發(fā)育有明顯的抑制作用，而這種作用可能與影響Reelin信號的正常傳遞有關(guān)。本研究為妊娠晚期用地塞米松可引起后代患神經(jīng)精神性疾病提供了理論依據(jù)。