佟美姣，高雪麗，鄭世民*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030；2.寶清縣動物疫病預(yù)防與控制中心，黑龍江省雙鴨山 155600)

p53基因在機體內(nèi)有多種作用，能夠調(diào)控細胞周期，修復(fù)損傷DNA，抑制腫瘤發(fā)生，維持基因穩(wěn)定。各物種之間保守區(qū)序列為DNA結(jié)合域的氨基酸主要的突變區(qū)域集中在編碼區(qū)為5-8外顯子[1]。1988年，雞p53基因從脾細胞cDNA文庫中被克隆出來，與人P53蛋白有47%相似性[2]。研究表明，在雞體內(nèi)p53的過量表達能夠抑制新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒復(fù)制[3-4]，起到保護的作用。檢測p53基因的方法很多，有DNA測序、色譜法、免疫組織化學(xué)、變性梯度凝膠電泳法、生物芯片、高分辨率溶解曲線技術(shù)、高通量基因測序等[1,5]，但是應(yīng)用在雞體內(nèi)研究的方法較少。熒光定量PCR敏感性高，特異性和重復(fù)性好，應(yīng)用到多種基因檢測中效果良好[6]。根據(jù)目前研究的結(jié)果，本文將建立一種應(yīng)用于檢測雞p53 mRNA的實時熒光定量PCR方法，希望能更加精確檢測禽類p53 mRNA的表達，為之后的相關(guān)研究打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF雞，21日齡，品種CSIRO-MVS，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 毒株 傳染性法氏囊病病毒(IBDV)強毒(J1C7)株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要試劑 質(zhì)粒DNA小量試劑盒，愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品；M-MLV Reverse Transcriptase，Promega(美國)公司產(chǎn)品；Oligo(dT)15，天根生物(北京)有限公司產(chǎn)品；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TrizolLS Reagen，Invitrogen(美國)公司產(chǎn)品；感受態(tài)細胞DH5α、pMD18-T載體，TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 熒光定量PCR儀(LightCycler2.0)，美國羅氏公司產(chǎn)品；PCR儀(PTC-200)，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(GDS-800)，美國UVP公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 相關(guān)引物 參考GenBank發(fā)表的雞p53相關(guān)序列，利用相關(guān)軟件設(shè)計引物，p53引物(基因序列號NM205264)P1：CCCATCCTCACCATCCTTACA，P2：CTCGATCTTGCGGTCCCTC，片段長度108 bp；β-actin引物參照已經(jīng)發(fā)表的文獻[7]進行合成(基因序列號AW61617)，β1：TGAAGCCCAGAGCAAAAGAGGTAT，β2：TGCTCCTCAGGGCTACTCTC，片段長度135 bp。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 98只21日齡SPF雛雞隨機分為對照組(C組)與病毒感染組(I組)，分別進行如下處理：C組(44只)，雛雞于21日齡經(jīng)滴鼻、點眼給予滅菌PBS，100 μL/只；I組(54只)，雛雞于21日齡經(jīng)滴鼻、點眼感染IBDV稀釋液，100 μL/只。

1.2.2 合成DNA模板 采用Trizol試劑，提取雞免疫器官中的總RNA，所得產(chǎn)物用20 μL DEPC水保存?？俁NA通過瓊脂凝膠電泳，利用紫外分光光度儀進行分析，計算OD260 nm、OD280 nm值，通過其比值對所提取的RNA進行鑒定。質(zhì)量良好完整的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的片段擴增 建立PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(P1/P2、β1/β2，10 μmol/L)各0.5 μL，制備的cDNA 2.0 μL，EasyTaq(5 U/μL)0.1 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL，ddH2O 17.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL。

反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火p53引物55℃，β-actin 引物58℃[7]，均是30 s；延伸72℃ 30 s；30個循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。電泳觀察PCR產(chǎn)物。

1.2.4 標準品的制備 按照試劑盒的說明對PCR產(chǎn)物進行回收，經(jīng)過純化后，把p53、β-actin擴增產(chǎn)物與載體pMD18-T鏈接。鏈接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，通過PCR鑒定以及基因序列測定，提取鑒定為陽性克隆株的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 優(yōu)化反應(yīng)條件 利用普通PCR對試驗條件進行優(yōu)化，例如引物濃度、模板用量及退火溫度，通過多次的PCR反應(yīng)，對所需要的條件進行摸索，尋找最優(yōu)組合方案，進行試驗。

1.2.6 制作標準曲線 本試驗是以所提取的重組陽性克隆質(zhì)粒稀釋品為模板，利用設(shè)計的雞p53、β-actin引物，進行Real -Time PCR擴增，制作標準曲線。用p53、β-actin基因陽性克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。

試驗所用的反應(yīng)體系為20 μL：陽性質(zhì)粒2.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μL，lPlatinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(2×)10.0 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，滅菌ddH2O補足。

試驗程序為：預(yù)變性95℃ 2 min；變性95℃ 20 s，退火55℃ 20 s，延伸72℃ 10 s，45個循環(huán)，在每次運行退火之后采集熒光信號。每次試驗均設(shè)置陰性對照品。反應(yīng)完成后，確定反應(yīng)的擴增曲線、熔解曲線并制作標準曲線，利用分析軟件自動進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.7 重復(fù)性試驗 為判定擴增反應(yīng)的特異性，以p53、β-actin 重組陽性質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，即100～10-9，每稀釋度的樣品做3次重復(fù)性試驗。根據(jù)每次試驗的相應(yīng)熔解曲線進行判斷。

1.2.8 所建檢測方法的應(yīng)用 方法建立后，以21日齡SPF雛雞為研究對象，分別對IBDV感染雛雞和未感染雛雞的法氏囊、胸腺及脾臟中的p53 mRNA表達進行real-time PCR檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，比較組間差異。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 總RNA電泳結(jié)果

對所提取的雞免疫器官的總RNA樣品進行質(zhì)量鑒別，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，所得到的圖顯示，總RNA的28S、18S、5S三處條帶清晰可見。用核酸蛋白紫外分析儀對其檢測，發(fā)現(xiàn)樣品的OD260/OD280值為1.8，與理論值相符合，表明所提取的總RNA樣品質(zhì)量優(yōu)質(zhì)，有良好的完整性(圖1)。

1.DL 2 000 Marker; 2.陰性對照; 3.總RNA1.DL 2 000 Marke; 2.Negative control; 3.The total RNA

2.2 擴增目的基因

Oligo(dT)15為引物，擴增雞免疫器官總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA 為模板，進行目的基因p53、β-actin擴增，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，所擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2、圖3，目的條帶清晰。經(jīng)過測序，并與p53、β-actin于GenBank已發(fā)表序列相關(guān)序列進行比對，符合相關(guān)要求，可以用于之后的試驗。

1.DNA Marker DL 2 000; 2.p53 RNA; 3.陰性對照1.DNA Marker DL 2 000; 2.p 53 RNA; 3.Negative control

1.DNA Marker DL 2 000; 2.β-actin RNA; 3.陰性對照1.DNA Marker DL 2 000; 2.β-actin RNA; 3.Negative control

2.3 制備標準曲線

利用程序軟件繪制標準曲線，p53以及β-actin的重組陽性質(zhì)粒作為標準品，把重組陽性質(zhì)粒做10倍稀釋，熒光定量PCR儀進行擴增，根據(jù)所得的結(jié)果，選擇適合濃度的陽性質(zhì)粒作為標準品，制作標準曲線，所得結(jié)果見圖4與圖5。

圖4 p53標準曲線圖

圖5 β-actin標準曲線圖

2.4 相關(guān)特異性分析

通過反應(yīng)，重組陽性質(zhì)粒p53、β-actin的標準品熔解曲線呈現(xiàn)單峰，峰值分別是90℃、82℃左右(圖6、圖7)，陰性對照品曲線平直，無雜峰出現(xiàn)，說明只有單一擴增產(chǎn)物，而且引物有良好特異性。

圖6 p53熔解曲線

圖7 β-actin熔解曲線

2.5 IBDV感染SPF雛雞免疫器官中p53 mRNA表達的變化

IBDV感染SPF雛雞，其胸腺和脾臟p53 mRNA表達在病毒感染后3 d極顯著(P<0.01)高于相應(yīng)對照雛雞，胸腺與脾臟p53 mRNA表達量雖然分別在病毒感染后1 d與5～28 d低于相應(yīng)對照雛雞，但未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；法氏囊p53 mRNA在病毒感染后5～7 d不同程度高于相應(yīng)對照雛雞(P<0.05)，其他檢測點病毒感染雛雞雖有不同程度的降低，但與對照雛雞相比統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P>0.05)(表2)。

3 討論

當機體發(fā)生細胞損傷時，p53基因通過多種途徑進行調(diào)控，修復(fù)損傷DNA[8]。如修復(fù)失敗后，p53基因還能促進細胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生[9]。檢測p53基因的研究主要集中在腫瘤性疾病，由于p53基因突變類型較多，突變的位點多，研究的方法種類也很多[10]。各種檢測方法，各有所長，具體應(yīng)用何方法可以根據(jù)研究內(nèi)容決定。實時熒光定量PCR方法靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強，已應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域[11]。杜先平[12]等用熒光定量方法檢測了人結(jié)腸癌患者p53基因表達水平，結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR方法檢測p53敏感性和特異性都很高。

呂瀛娟等應(yīng)用SYBR GREENⅠRT-PCR檢測大鼠外傷性視神經(jīng)損傷動物模型p53 mRNA表達變化規(guī)律，結(jié)果顯示，此方法有擴增效率高、特異性強、靈敏度高、Ct值線性范圍廣、可重復(fù)性好的特點[13]。呂曉萍等[14]利用SYBR GREEN I Real-time PCR方法檢測了雞體內(nèi)IL-2 mRNA的表達情況，檢測的方法靈敏、重復(fù)性良好，獲得了良好的檢測結(jié)果。隋欣等也建立了實時熒光定量PCR方法檢測雞體內(nèi)MUC2的表達，結(jié)果準確[15]。通過以上研究，可以看出實時熒光定量PCR方法在雞上應(yīng)用檢測良好。本試驗基于已有的研究結(jié)果，建立了雞p53 mRNA絕對定量檢測的雙標準曲線Real-time PCR方法，此方法以β-actin作為參照物，通過Ct以及相應(yīng)的標準曲線，對所得數(shù)據(jù)進行歸一化處理[16]，可以算出p53的表達量。通過本試驗，可以看出此種檢測方法的特異性良好，熔解曲線單一，未見二聚體和非特異性產(chǎn)物。制作標準曲線過程中對重組質(zhì)粒的各稀釋度進行相關(guān)檢測，試驗的重復(fù)性良好，而且有較高的靈敏度。