楊樹寶，張桂山，徐 晶，張英楠 ,3*

(1.吉林醫(yī)藥學院，吉林 132013；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118；3.長春科技學院，長春 130600)

呼吸道直接與外界相通，是機體最先接觸細菌、病毒等病原微生物的部位。呼吸道黏膜下的固有層內(nèi)存在一些淋巴組織，構(gòu)成了機體抵御外界病原微生物入侵的第一道免疫屏障，可提供對多種細菌和病毒等黏膜致病原侵襲的保護，這些淋巴組織被稱為呼吸道相關(guān)性淋巴組織(respiratory-associated lymphoid tissue,RALT)，包括鼻黏膜相關(guān)淋巴組織(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)、支氣管相關(guān)淋巴組織(bronchus-associated lymphoid tissue,BALT)以及分布于喉和氣管黏膜中的淋巴組織[1-3]。存在于這些淋巴組織中的T、B淋巴細胞是RALT的最重要的免疫細胞，對于局部及整個機體的免疫保護發(fā)揮重要作用。

課題組前期已經(jīng)對不同日齡家禽的鼻、氣管以及肺臟中的T淋巴細胞亞群的定位分布變化進行了報道[4-6]，并證明鼻、氣管和肺臟中淋巴細胞的類型、定位分布以及數(shù)量都呈日齡相關(guān)性變化，而這些變化又可以反映呼吸道黏膜及機體的免疫狀態(tài)。

喉作為呼吸道的重要組成部分，突出于呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)所組成的十字交叉處，由此定位的特殊性和重要性使其成為黏膜免疫的關(guān)鍵部位。喉腔內(nèi)壁層是假復(fù)層柱狀纖毛上皮，固有膜淺層有黏液性腺泡，其周圍分布有淋巴組織。一方面流經(jīng)鼻咽部的混于空氣中的懸浮顆粒和病原菌一定會經(jīng)過喉口進入氣管或肺臟，另一方面，由支氣管和氣管所分泌的黏液也會經(jīng)過喉口進入口咽部[7]。喉作為下呼吸道的門戶，在呼吸道局部免疫中起到重要作用。

目前關(guān)于喉部淋巴組織的研究較少，僅有學者對人、牛和豬的喉部淋巴組織進行過研究報道[8-12]，但是對家禽至今還未見相關(guān)報道。本研究用免疫組織化學方法結(jié)合計算機圖象分析技術(shù)觀察不同生長發(fā)育階段CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群在喉黏膜中的出現(xiàn)、組織定位和分布等，從而反映不同發(fā)育時期雞喉黏膜的免疫狀態(tài)，為進一步研究家禽喉黏膜的免疫機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 200枚海蘭白雞種蛋，購自長春凈月潭旅游開發(fā)區(qū)銀河養(yǎng)殖場，種蛋進行常規(guī)孵化，雛雞進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 冰凍切片用OCT組織包埋液，美國Sakura公司產(chǎn)品；小鼠抗雞CD4和CD8單克隆抗體，美國Southern Biotechnology公司產(chǎn)品；Ultra Sensitive SP超敏試劑盒kit 9901，福州邁新公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 依愛EIF/C.DME3456 孵化機/出雛機，廣東依愛孵化機廠產(chǎn)品；Leica CM1850 冰凍切片機，德國Leica公司產(chǎn)品；Olympus CX41 顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；Pixera pro150ES圖像采集器，美國Pixera公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 200只試驗用海蘭白雞種蛋進行孵化，雞出殼后置于動物室中常規(guī)飼養(yǎng)。分別選擇未經(jīng)過疫苗免疫的18日、20日雞胚，1、4、7、14、21、35、56日齡的雛雞，每個時期隨機選取3只雞胚或雛雞，頸部脫臼致死后取喉口至氣管交界處的喉組織，并且將外表的喉肌去除，保留喉軟骨及喉腔內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

將上述組織按照取材和修塊時的預(yù)定切面分別垂直置于冰凍切片OCT包埋液中包埋，液氮速凍后進行冰凍切片，片厚5 μm，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫組織化學染色程序 每張切片滴加30 mL/L過氧化氫，室溫下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞CD4和CD8單克隆抗體工作液，37℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每張切片滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每張切片加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；自來水沖洗返藍；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片；拍照。

1.2.3 圖像分析及統(tǒng)計學處理 應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測定喉黏膜中單位視野內(nèi)陽性細胞面積。同一日齡選取3個樣本，每個樣本制作3張連續(xù)切片，每張切片10倍物鏡下隨機選取3個視野，取平均值。應(yīng)用SPSSl 8.0軟件對不同日齡的同一陽性細胞進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 胚胎期及出殼后1～14日齡雞喉黏膜組織中CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞的分布

免疫組化染色的圖片中著色為棕色的細胞判定為陽性細胞，并通過計算陽性細胞的面積對相對數(shù)量進行比較分析。

胚胎20日齡和出殼后1日齡時，喉黏膜中沒有CD4+和CD8+T淋巴細胞出現(xiàn)。4日齡時，CD4+和CD8+T淋巴細胞都首次出現(xiàn)在喉黏膜中，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中(圖1A，圖1B)，此時CD4+T淋巴細胞的數(shù)量顯著低于CD8+T淋巴細胞(P<0.05)(圖2)。

7日齡時，喉黏膜中CD4+和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量都顯著增加(P<0.05)(圖2)，而且在喉黏膜中形成淋巴聚集物，其表面仍被假復(fù)層柱狀纖毛上皮所覆蓋，CD4+和CD8+T淋巴細胞都主要分布在淋巴聚集物的中下部區(qū)域，而且主要以CD4亞群為主(圖1C)，而CD8亞群相對較少(圖1D)。

14日齡時CD4+T淋巴細胞的數(shù)量增加，而CD8+T淋巴細胞下降，但與7日齡比較差異均不顯著(P>0.05)，同時CD4+T淋巴細胞的數(shù)量顯著高于CD8+T淋巴細胞(P<0.05)(圖2)。此時喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是淋巴細胞散布在幾乎所有部位的喉黏膜固有層中，局部形成小的淋巴聚集物，其中CD4+T淋巴細胞分布較集中(圖1E)，而CD8+T淋巴細胞較分散，但分布范圍較廣，黏膜上皮中也有CD8+T淋巴細胞存在(圖1F)。

2.2 21～56日齡雞喉黏膜組織中CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞的分布及數(shù)量變化

21日齡時，喉黏膜固有層中淋巴細胞更為集中，CD4+T淋巴細胞集中在黏膜固有層中下部區(qū)域(圖1G)，而CD8+T淋巴細胞與14日齡時相似，分散在整個黏膜固有層中，黏膜上皮內(nèi)也有個別CD8+T淋巴細胞存在。此時，CD4+T淋巴細胞的數(shù)量繼續(xù)增加，并顯著高于14日齡(P<0.05)，而CD8+T淋巴細胞無明顯變化，因此CD4+T淋巴細胞的數(shù)量更顯著高于CD8+T淋巴細胞(P<0.05)(圖2)。

35日齡時，在喉口處黏膜口腔面復(fù)層扁平上皮下的固有層黏液腺周圍也出現(xiàn)較大的淋巴聚集物，而且也是以CD4亞群為主，并占據(jù)聚集物的中央(圖1H)。此時，CD4+T淋巴細胞的數(shù)量仍繼續(xù)增加，但與21日齡比較差異并不顯著(P>0.05)，而且CD4+T淋巴細胞仍顯著多于CD8+T淋巴細胞(P<0.05)，與14日齡和21日齡相似，CD4+T淋巴細胞的數(shù)量大概是CD8+T淋巴細胞的兩倍(圖2)。

56日齡時，CD8+T淋巴細胞的數(shù)量急劇增加，并且大量分布在生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域(圖1I)，此時數(shù)量與CD4+T淋巴細胞接近，兩者比較差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

A.4日齡(250×)，箭頭：正中黏膜嵴中的CD4+細胞；B.4日齡(250×)，箭頭：正中黏膜嵴中的CD8+細胞；C.7日齡(100×)，箭頭：淋巴聚集物中的CD4+細胞；D.7日齡(100×)，箭頭：淋巴聚集物中的CD8+細胞；E.14日齡(250×)，箭頭：淋巴聚集物中的CD4+細胞；F.14日齡(250×)，箭頭：淋巴聚集物中的CD8+細胞；G.21日齡(250×)，箭頭：黏膜固有層中下部的CD4+細胞；H.35日齡(250×)，箭頭：口腔面復(fù)層扁平上皮下固有層黏液腺周圍的淋巴聚集物；I.56日齡(250×)，細箭頭：濾泡間區(qū)域中的CD8+細胞；粗箭頭：生發(fā)中心

3 討論

動物的喉一直以來被認為只是呼吸管道中一個惰性機械瓣膜，氣體通過的一個閥門，與免疫關(guān)聯(lián)并不大。然而，對人和動物的研究表明，喉黏膜中確實存在大量的淋巴組織，這些淋巴組織其中一部分是以淋巴上皮濾泡的形式存在，即為喉黏膜相關(guān)淋巴組織(LALT)，而且呈現(xiàn)年齡和疾病依賴性變化。除比較集中的LALT以外，與腸道和氣管黏膜一樣，大多數(shù)免疫活性細胞呈彌漫性存在于喉黏膜中，但也有小的淋巴聚集物存在[8-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，雞14日齡時喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是CD4+和CD8+T淋巴細胞散布在幾乎所有部位的喉黏膜固有層中，局部形成小的淋巴聚集物，其中CD4+T淋巴細胞分布較集中。另外，56日齡時，喉黏膜中出現(xiàn)主要由生發(fā)中心構(gòu)成的淋巴濾泡，并且CD4+和CD8+T淋巴細胞分布在生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域，從而也形成典型的LALT。

同一日齡肩標*表示差異顯著(P<0.05)，無*標注表示差異不顯著(P>0.05)；不同日齡同一種細胞肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

本研究與其他學者對人和其它哺乳動物對喉淋巴組織的研究結(jié)果較一致，均發(fā)現(xiàn)喉黏膜中的LALT以及彌散性的淋巴細胞及組織均呈現(xiàn)日齡相關(guān)性變化[8-13]，如對人的研究發(fā)現(xiàn)，年齡小于20歲時，LALT較20歲以上的人更為發(fā)達[13]；犢牛會厭軟骨以及杓狀軟骨黏膜中的LALT較為發(fā)達，而且隨著日齡增長，LALT越來越發(fā)達[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，從4日齡時CD4+和CD8+T淋巴細胞在喉黏膜中首次出現(xiàn)，一直到56日齡時，CD4+和CD8+T淋巴細胞都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中，隨著日齡增長CD4+T淋巴細胞的數(shù)量逐漸增加，而CD8+T淋巴細胞的數(shù)量變化不大。這些淋巴細胞之所以能都集中出現(xiàn)在喉腔底壁的正中黏膜嵴，其原因可能是此處位置較低，喉腔中的黏液更多的匯集于底壁，因此此處黏附空氣中的病原菌和顆粒物能力較強，另外正中黏膜嵴在此處突出，與經(jīng)過喉口進入喉腔的氣體接觸頻繁，因此接觸病原的機率較大，并且此處的黏膜較厚，固有層中血管等較發(fā)達，從而使免疫細胞較易在此處定植，從而行使免疫功能。

Casteleyn等[8]對犢牛的研究發(fā)現(xiàn)，在喉的會厭和杓狀軟骨突起部分的黏膜中存在大量的淋巴濾泡。犢牛喉腔中這些突起部位存在大量淋巴組織恰好與本研究發(fā)現(xiàn)的在雞喉腔底部突起的正中黏膜嵴中存在淋巴聚集物相似，也主要是由于這些突出部位會與經(jīng)過喉口進入喉腔的氣體頻繁接觸，因此接觸病原的機率較大，從而使免疫細胞較易在此處定植，形成較為發(fā)達的淋巴組織。

Barker等[12]對豬喉黏膜淋巴組織的研究發(fā)現(xiàn)，喉黏膜上皮和固有層中均出現(xiàn)以T淋巴細胞為主的淋巴聚集物體，CD4+和CD8+T淋巴細胞雖然同時存在于所有部位，但數(shù)量差別較大，聲門下區(qū)域黏膜中CD4+T淋巴細胞明顯多于CD8+T淋巴細胞，這與本研究發(fā)現(xiàn)的在正中黏膜嵴中CD4+T淋巴細胞明顯多于CD8+T淋巴細胞的結(jié)果較一致，雞的正中黏膜嵴和豬的聲門下區(qū)域的黏膜位置均較低，黏附空氣中的病原菌和顆粒物能力較強，從而使B淋巴細胞較易在此處定植產(chǎn)生相應(yīng)抗體執(zhí)行體液免疫應(yīng)答，而更多的CD4+T淋巴細胞會募集于此，輔助B淋巴細胞參與免疫應(yīng)答。