翟雪潔，宋瑞其，郝蘊偉，何文文，鄭會珍，祖力亞·克力木江，劉一凡，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

蜱是一種重要的吸血性體外寄生蟲，是除蚊子外第二大病媒，不僅對動物和人體造成直接傷害，還是人畜共患傳染病病原的傳播媒介和儲存宿主[1]。亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum,H.as)和小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum,H.an)屬于硬蜱科璃眼蜱屬，主要分布于伊朗、哈薩克斯坦[2]、蒙古[3]、印度、巴基斯坦及中國新疆[4]和內(nèi)蒙古[5]等地，是新疆的優(yōu)勢蜱種[6-7]。該蜱及其傳播的疾病不僅對人類和動物的健康構(gòu)成了威脅，而且造成了農(nóng)牧民巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]?，F(xiàn)如今，控制蜱蟲的主要手段依然是化學(xué)藥劑殺滅，但存在如藥物殘留、食品安全和環(huán)境污染等諸多問題[9]?？跪缫呙缱鳛榻鼛啄甑囊粋€熱點研發(fā)方向，不僅可以保護(hù)人和動物不受其侵害，還可以有效避免環(huán)境污染和耐藥性等問題。鐵蛋白(ferritin)為動植物體內(nèi)廣泛存在的一類儲存鐵的蛋白，在生物體內(nèi)有調(diào)節(jié)鐵代謝平衡、抗氧化脅迫、消除部分重金屬和有毒分子的毒害等功能[10]。有研究表明 ，鐵蛋白在沒有獲得性免疫系統(tǒng)的節(jié)肢動物的先天免疫中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。蜱以吸血為生，在消化和吸收含有大量鐵元素的宿主血液時，鐵蛋白的功能顯得非常重要。本研究基于H.as和H.an的Fer2基因序列構(gòu)建重組質(zhì)粒、原核表達(dá)重組蛋白并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后用純化后的重組蛋白免疫 Balb/c 小鼠，制備鼠抗H.as和H.an重組蛋白多克隆抗體，并通過 Western blot 檢測抗原性，以期為后續(xù)抗蜱疫苗研制篩選保護(hù)性候選抗原提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱和實驗動物 亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院寄生蟲實驗室提供；清潔級Balb/c小白鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 pGEX-4T-1、pET-28a載體由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院寄生蟲實驗室提供；pEASY-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為Takara公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司產(chǎn)品；TRIZOL試劑、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4連接酶，Takara公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水均為超純水。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(T100)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(CTR16-2)，北京時代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機(jī)(H1650)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；超凈臺(SW-SJ-2D)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；臺式恒溫振蕩器(THZ-D)，金壇市盛蘭儀器制造有限公司產(chǎn)品；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-IIN)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；穩(wěn)壓電泳儀(DYY-Ⅲ-5)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蜱的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取實驗室飼養(yǎng)亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱半飽血雌性成蜱，分別用預(yù)冷PBS清洗后，置于液氮中進(jìn)行研磨成粉未狀，使用500 μL PBS重懸，加入2 mL Trizol試劑，于渦旋儀進(jìn)行渦旋，之后按照Trizol RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作；將提取的總RNA使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與目的基因的擴(kuò)增 基于亞洲璃眼蜱Fer2基因序列(KT924235)和小亞璃眼蜱Fer2基因序列(ALJ92581.1)利用PrimerPremier 5.0和Oligo 6.24(綠色版英文)軟件設(shè)計特異性原核表達(dá)PCR引物，引物序列信息見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 表達(dá)載體構(gòu)建引物

以cDNA為模板對Fer2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃/54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳加以驗證，并根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段膠回收。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將回收的Fer2基因片段物連接到pEASY-T1克隆載體中，轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落分別接種至含100 μg/mL氨芐青霉素(rHasFer2)和卡那霉素(rHanFer2)的LB液體培養(yǎng)基中，收集菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取克隆質(zhì)粒(pEASY-T1/HasFer2、pEASY-T1/HanFer2)，分別對pGEX-4T-1、pET-28a空載質(zhì)粒和克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)，回收空載和目的片段，使用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌液送上海生工公司進(jìn)行測序，測序正確后提取重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/HasFer2、pET-28a/HanFer2，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)驗證。

1.2.4 蛋白特性預(yù)測 用生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析HasFer2和HanFer2的結(jié)構(gòu)和功能。Prot Param軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的分子量及等電點等；TMHMM軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP-5.0 Server在線分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；Antibody Epitope Prediction在線分析軟件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)分析B細(xì)胞表位；利用在線分析軟件SYFPEITHII(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/FindYourMotif.htm)分析T細(xì)胞表位；PSORTII 在線分析軟件(https://psort.hgc.jp/)分析亞細(xì)胞定位；使用SWISS-MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三級空間模型，然后使用EzMol-2.1在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～ezmol/)對蛋白進(jìn)行建模，并對空間抗原表位進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.5 rHasFer2和 rHanFer2 的表達(dá)及純化 分別在含100 μg/mL氨芐青霉素(rHasFer2)和卡那霉素(rHanFer2)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600=0.4～0.6時使用終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h，測定rHasFer2和rHanFer2的表達(dá)情況。rHasFer2使用8 mol/L尿素超聲破碎后，離心收集上清，分別置于4 mol/L、2 mol/L、0 mol/L尿素溶液以及 PBS 中進(jìn)行蛋白復(fù)性和純化[13]；rHanFer2 使用His Trap親和層析柱純化，通過15 g/L的SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達(dá)和純化情況。

1.2.6 免疫試驗 使用9只6周齡～8周齡的無菌Balb/c雌性小鼠，分為3組，分別取100 μg rHasFer2/rHanFer2與等體積氫氧化鋁佐劑進(jìn)行渦旋乳化，分別免疫3只小鼠，采用背部皮下多點注射，對照組3只Balb/c小鼠注射等體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在免疫后的21 d斷尾采血，分離血清并保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 SDS-PAGE和Western blot分析 取10 μL(約5 μg)rHasFer2和rHanFer2經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用封閉液(50 g/L脫脂乳，PBST稀釋)于4℃進(jìn)行過夜封閉；以免疫蛋白21 d的小鼠血清(1∶100 稀釋)為一抗，以免疫 PBS的小鼠血清作為陰性對照，37℃孵育2 h；加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶1000稀釋)于37℃孵育2 h。每個反應(yīng)步驟之后使用PBS洗滌3次。最后滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建pGEX-4T-1/HasFer2和pET-28a/HanFer2重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切驗證插入基因片段大小與預(yù)期大小一致(圖 1)，測序結(jié)果為目的片段，表明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/HasFer2和pET-28a/HanFer2構(gòu)建成功。

A.pGEX-4T-1/HasFer2重組質(zhì)粒；B.pET-28a/HanFer2重組質(zhì)粒；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1：酶切前；2：酶切后

2.2 蛋白特性預(yù)測結(jié)果

Prot Param軟件分析HasFer2和HanFer2氨基酸序列的理化性質(zhì)(表2)。通過在線分析軟件TMHMM對HasFer2跨膜區(qū)預(yù)測，可知其1-193位氨基酸均位于胞外；SignalP-5.0對蛋白信號肽預(yù)測，可知的18-19位氨基酸是信號肽；B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果(表 3)。 HanFer2跨膜區(qū)預(yù)測1-12位氨基酸位于胞內(nèi)、13-30位氨基酸位于跨膜區(qū)、31-204位氨基酸位于胞外；信號肽預(yù)測是29-30位氨基酸；B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果(表3)。均無T細(xì)胞表位。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明HasFer2主要存在于胞外(66.7%)和分泌系統(tǒng)的囊泡(22.2%)，且線粒體(11.1%)中也有少量分布；HanFer2主要分布于胞質(zhì)(34.8%)和胞外(26.1%)，且在線粒體(17.4%)、細(xì)胞核(8.7%)、分泌系統(tǒng)的囊泡(8.7%)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.3%)中也有少量分布。利用在線SWISS-MODEL軟件預(yù)測Fer2的3D模型，是由24個亞基組成的球形低聚物，使用EzMol-2.1對蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行標(biāo)記，HasFer2和HanFer2(圖 2)。

表2 氨基酸理化性質(zhì)

表3 B細(xì)胞表位預(yù)測

2.3 rHasFer2和rHanFer2的表達(dá)、純化及免疫印跡

重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/HasFer2和pET-28a/HanFer2導(dǎo)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)rHasFer2(47.45 ku)和rHanFer2(28.95 ku)。rHasFer2以包涵體形式表達(dá)在沉淀中，用透析法復(fù)性純化，rHanFer2使用His Trap親和層析柱純化，通過150 g/L的SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達(dá)、純化情況(圖 3)。重組蛋白大小與預(yù)期重組蛋白大小基本一致，純化后蛋白條帶單一。經(jīng)Western blot分析表明，rHasFer2和rHanFer2均能被抗血清特異性識別。

A.Fer2 3D結(jié)構(gòu)，為24個亞基構(gòu)成的球體；B.Fer2亞基模型，B細(xì)胞表位(紅色區(qū)域)；C.Fer2亞基向右旋轉(zhuǎn)180°展示，B細(xì)胞表位(紅色區(qū)域)

A：rHasFer2；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.純化前；3、4.純化后；5.免疫印跡結(jié)果；6.陰性對照；B：rHanFer2；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前；2、3.純化后；4.免疫印跡結(jié)果；5.陰性對照A：rHasFer2；M.Protein Marker；1,2.Before purification；3,4.After purification；5.Western blot results；6.Negative control; B：rHanfFer2；M.Protein Marker；1.Before purification；2,3.After purification；4.Western blot results；5.Negative control

3 討論

亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱可傳播出血熱、立克次體病、萊姆病和森林腦炎等傳染病，近年有新的蜱傳病原被發(fā)現(xiàn)，如兩種蜱均可傳播的克里米亞-剛果出血熱為烈性傳染病，國內(nèi)主要流行于新疆南部，人群普遍易感。Bm91、絲氨酸蛋白酶抑制劑(RAS-1、RAS-2、RAS-3 和 RAS-4)和鐵蛋白 2[14]等作為抗蜱疫苗候選抗原，已研制出基于微小牛蜱 Bm86 基因的抗蜱亞單位疫苗，但存在宿主選擇性和交叉保護(hù)效率不高的問題[15-16]。所以篩選可保護(hù)動物的優(yōu)良抗蜱抗原尤為重要。宿主血液是蜱蟲生存和繁殖所需能量的唯一來源，在蜱蟲消化血液的過程中，不僅血液中的微生物會給蜱體造成損傷，而且鐵元素過量亦會造成鐵中毒。蜱有一種解毒機(jī)制，F(xiàn)er2 在該機(jī)制中起到了維持鐵平衡等重要作用，降解在中腸消化囊泡(血小體)中血紅蛋白消化導(dǎo)致的過量血紅素聚集，抵御過多鐵帶來的有害影響。國內(nèi)有關(guān)寄生蟲鐵蛋白研究主要報道于蠕蟲方面，在蜱方面研究了麻點璃眼蜱、鈍刺血蜱、鐮形扇頭蜱和微小牛蜱等少數(shù)蜱種。在微小牛蜱鐵蛋白研究中，其被認(rèn)為在蜱體內(nèi)起到對過多鐵進(jìn)行貯存和調(diào)控的解毒作用，使鐵維持在正常生理水平[17]。在麻點璃眼蜱鐵蛋白研究中顯示，干擾 HrFer2 基因會顯著削弱蜱的吸血功能[18]。有研究證明 Fer2 是蓖麻硬蜱腸道和周圍組織之間非血紅素鐵的主要轉(zhuǎn)運體[19-20]。本研究對亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱 Fer2 進(jìn)行跨膜、信號肽和蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示兩者均具有信號肽且在細(xì)胞外和囊泡中有定位，在亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱體內(nèi) Fer2 蛋白可能被運輸?shù)侥ね獍l(fā)揮作用。體液免疫應(yīng)答在抗蜱保護(hù)方面的作用已在許多免疫研究中得到證實，疫苗效力與抗體應(yīng)答直接相關(guān)，在長角血蜱的研究發(fā)現(xiàn)，吸食免疫 rHIFER2 的家兔血液的蜱飽血重量與對照組相比明顯下降，并限制了長角血蜱的生長和繁殖[21]。本研究對 HasFer2 和 HanFer2 T 細(xì)胞表位、B 細(xì)胞表位預(yù)測和應(yīng)用 SWISS-MODEL 基于同源建模的方法構(gòu)建 Fer2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，雖然兩者的 Fer2 蛋白可能不含 Th 細(xì)胞表位，不能介導(dǎo)細(xì)胞免疫，但均有 B 細(xì)胞表位且大部分暴露在表面，說明能較好的被識別和發(fā)揮功能，兩者作為抗原可能使宿主體產(chǎn)生較強的體液免疫，在免疫小鼠試驗中也得到了抗體效價較高的抗血清。本研究首次對新疆優(yōu)勢蜱種亞洲璃眼蜱和小亞璃眼蜱的 Fer2 基因進(jìn)行了克隆，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pEGEX-4T-1/HasFer2和pET-28a/HanFer2，對 HasFer2 和 HanFer2 兩個蛋白預(yù)測分析結(jié)果顯示，兩個蛋白均符合寄生蟲免疫學(xué)診斷和免疫防控候選基因的特點，高效表達(dá)出 rHasFer2 和 rHanFer2 重組蛋白，免疫小鼠后能產(chǎn)生特異性識別該蛋白的抗體，進(jìn)一步驗證了蛋白具有良好的抗原性，為后續(xù)在該蛋白功能、蜱免疫防治和抗蜱亞單位疫苗的研究提供了理論依據(jù)。