賈永超，周媛媛，嚴(yán) 平，郭 營(yíng)，王臨喜，尹榮蘭，郭忠博，王靜宜，王 超，尹榮煥*

(1.東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春 130062；3.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營(yíng)口 115009)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)能夠引起豬的多發(fā)性纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大[1]。由其作為病原引起的副豬嗜血桿菌病現(xiàn)已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的典型細(xì)菌性疾病之一[2]。顯微鏡下菌株形態(tài)呈現(xiàn)多形性，球狀或細(xì)絲狀均可見，無運(yùn)動(dòng)性，無芽孢和鞭毛，通常可見莢膜，但是在進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，莢膜容易丟失[3]。對(duì)于HPS血清分型，可以采用協(xié)同凝集試驗(yàn)(CA)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等方法。傳統(tǒng)的Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)瓊脂擴(kuò)散血清分型方法可以將HPS至少分為15個(gè)血清型，但也有26.2%菌株是不可分型的。目前HPS毒力相關(guān)因子和毒力基因的研究一直在進(jìn)行，但其致病機(jī)理及其毒力因子較為復(fù)雜，因此在疾病的預(yù)防和治療方面還存在很大的困難。

細(xì)菌small RNA(sRNA)是一類長(zhǎng)度在40 nt～500 nt之間的RNA分子，可以在細(xì)胞基因組中被轉(zhuǎn)錄但不能編碼蛋白質(zhì)[4]，大部分的sRNA存在于兩個(gè)蛋白基因編碼區(qū)之間，也有一些位于編碼基因5′和3′ UTR區(qū)域。大多數(shù)sRNA通過與特定的mRNA靶點(diǎn)相互作用、調(diào)節(jié)信息穩(wěn)定性、改變其對(duì)翻譯機(jī)制的可及性，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[5]。研究表明，sRNA在病原微生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激、細(xì)菌毒力等方面發(fā)揮著重要作用[6-7]，而HPS相關(guān)sRNA的研究還未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，sRNA64和sRNA145在血清型9型HPS(YK1603)、13型HPS(CY1201)遼寧分離株中差異表達(dá)，因此本文以這2個(gè)血清型菌株為研究對(duì)象，通過對(duì)體外不同生長(zhǎng)期以及感染PK-15細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的sRNA64和sRNA145轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，為sRNA在HPS不同毒力菌株致病機(jī)制中的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 血清型9型HPS(YK1603)、13型HPS(CY1201)遼寧分離株，均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)，由長(zhǎng)春軍事獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、Gold-View(GV-Ⅱ)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；DMEM，Hyclone公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Mix，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 TC-96/G/H(b)型PCR儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；ABI全功能實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、HERAcell 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Olivera S設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌16S rDNA引物；根據(jù)Howell設(shè)計(jì)的血清YK1603、CY1201的特異性引物；根據(jù)GenBank(登錄號(hào)：CP001321.1)設(shè)計(jì)HPS 16S rRNA的RT-qPCR引物；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)sRNA64和sRNA145的RT-qPCR引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并按照說明書稀釋后保存到-20℃冰箱備用。

表1 相關(guān)引物及堿基數(shù)量

1.2.2 凍干細(xì)菌的復(fù)蘇培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)中取適量的YK1603、CY1201凍干菌粉，將其加入到含有20 g/L NAD和50 mL/L血清的TSB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h后，取菌液均勻涂布于含有20 g/L NAD和50 mL/L血清的TSA固體培養(yǎng)基上，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。復(fù)蘇后挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 16S rDNA及血清型的驗(yàn)證 在超凈工作臺(tái)中將TSA固體培養(yǎng)基中的菌落用無菌接種環(huán)挑取適量，混于磷酸鹽緩沖液(PBS)中作為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列以及血清型序列。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×TaqPCR Mix，6 μL ddH2O，2 μL DNA模板，引物各1 μL，陰性對(duì)照模板為ddH2O。16S rDNA反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。4℃結(jié)束反應(yīng)。血清型反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳中，120 V電壓，電泳30 min。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察分析。

1.2.4 副豬嗜血桿菌YK1603和CY1201菌株菌量與OD600值關(guān)系曲線的測(cè)定 將菌株接種于TSA固體培養(yǎng)基上，待到其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用無菌的PBS進(jìn)行洗板，將洗下來的細(xì)菌全部放置于10 mL的離心管中，振蕩器充分振蕩均勻后，吸取1 mL菌液到另一離心管中，向其中加入9 mL PBS，再次用振蕩器充分振蕩均勻，以此方法10倍倍比稀釋至10-8。稀釋后取各個(gè)離心管中菌液300 μL加入到96孔板中測(cè)定OD600，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取其平均值來避免誤差，然后取梯度為10-5、10-6、10-7、10-8的離心管中的菌液各100 μL，均勻涂布于適合其生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)30 min后，再倒置培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)開始進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5 副豬嗜血桿菌YK1603、CY1201菌株體外不同生長(zhǎng)時(shí)期的培養(yǎng) 將YK1603、CY1201菌株菌量調(diào)整為1×108CFU/mL，按1%接菌量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，分別取生長(zhǎng)遲緩期(細(xì)菌生長(zhǎng)6 h左右)、指數(shù)期(細(xì)菌生長(zhǎng)12 h左右)、穩(wěn)定期(細(xì)菌生長(zhǎng)18 h左右)、衰亡期(細(xì)菌生長(zhǎng)24 h左右)的YK1603、CY1201菌株提取RNA。

1.2.6 副豬嗜血桿菌YK1603、CY1201菌株感染PK-15細(xì)胞 復(fù)蘇后的PK-15細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞后，將YK1603、CY1201菌株按照5×107CFU/孔侵染細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，用PBS洗滌3次，棄掉上清液，換用含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，殺死胞外菌后，開始計(jì)時(shí)，取時(shí)間點(diǎn)0 h、9 h、24 h、48 h的細(xì)胞提取RNA。

1.2.7 總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 對(duì)體外不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)菌與殺死胞外菌后0 h、9 h、24 h、48 h的細(xì)胞提取RNA后進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體方法參照RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent說明書和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，產(chǎn)物置-20℃保存。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以1.2.7中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的結(jié)果設(shè)計(jì)的引物sRNA 64-F/sRNA64-R、sRNA145-F/sRNA145-R，16S rRNA為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-qPCR，重復(fù)試驗(yàn)3次。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，7.2 μL ddH2O，2 μL模板，引物各0.4 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?1)95℃預(yù)變性30 s；(2)循環(huán)反應(yīng)：95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；(3)熔解曲線：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用2-ΔΔCt方法，運(yùn)用IBS SPASS Statistics 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，GraphPadPrism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 凍干細(xì)菌的復(fù)蘇培養(yǎng)鑒定

在含有20 g/L NAD和50 mL/L血清的TSA固體培養(yǎng)基中可見邊緣整齊、表面光滑、半透明、灰白色小菌落。革蘭氏染色后油鏡下觀察，菌體呈紅色，為革蘭氏陰性菌，YK1603菌株主要呈現(xiàn)短桿狀，CY1201菌株以細(xì)絲狀為主，少數(shù)呈現(xiàn)短桿狀(圖1)。

A.YK1603 TSA菌落形態(tài); B.CY1201 TSA菌落形態(tài); C.YK1603染色鏡檢結(jié)果; D.CY1201染色鏡檢結(jié)果

2.2 16S rDNA及血清型鑒定

將PCR產(chǎn)物放置于10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳中鑒定，2株HPS菌株P(guān)CR擴(kuò)增16S rDNA序列產(chǎn)物電泳泳道均擴(kuò)增出822 bp的目的條帶(圖2A)，9型YK1603、13型CY1201菌株血清型分別擴(kuò)增出710 bp、840 bp的目的條帶(圖2B)。該結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增的片段大小均一致。

A：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000; 1.YK1603復(fù)蘇菌株; 2.CY1201復(fù)蘇菌株; 3.陰性對(duì)照; B：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000; 1.YK1603復(fù)蘇菌株; 2.YK1603復(fù)蘇菌株陰性對(duì)照; 3.CY1201復(fù)蘇菌株; 4.CY1201復(fù)蘇菌株陰性對(duì)照A：M.DNA Marker DL 2000; 1.YK1603 resuscitated strain; 2.CY1201 resuscitated strain; 3.Negative control; B：M.DNA Marker DL 2000; 1.YK1603 resuscitated strain; 2.YK1603 resuscitated strain negative control; 3.CY1201 resuscitated strain; 4.CY1201 resuscitated strain negative control

2.3 副豬嗜血桿菌YK1603、CY1201菌株菌量與OD600的關(guān)系

通過對(duì)YK1603和CY1201菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出了菌濃度與OD600之間的關(guān)系(圖3)：

YK1603菌株：y=9×106x-170 974，R2=0.999 2；

CY1201菌株：y=109x-4×107，R2=0.996 3。

A.YK1603菌株菌量與OD600的關(guān)系; B.CY1201菌株菌量與OD600的關(guān)系A(chǔ).Relationship between YK1603 strain and OD600; B.Relationship between CY1201 strain and OD600

2.4 副豬嗜血桿菌YK1603、CY1201菌株體外不同生長(zhǎng)時(shí)期sRNA64和sRNA145轉(zhuǎn)錄分析

sRNA64在YK1603菌株生長(zhǎng)過程中逐漸呈上調(diào)趨勢(shì)，衰亡期達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰，各生長(zhǎng)期間的轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05)，在CY1201菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰，穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于遲緩期(P<0.01)，顯著高于指數(shù)期和衰亡期(P<0.05)，且生長(zhǎng)過程中sRNA64的轉(zhuǎn)錄水平在指數(shù)期時(shí)YK1603與CY1201菌株呈現(xiàn)約2倍顯著差異(P<0.05)，穩(wěn)定期呈現(xiàn)約8倍極顯著差異(P<0.01)(圖4)；sRNA145在YK1603菌株生長(zhǎng)過程中逐漸呈上調(diào)趨勢(shì)，衰亡期達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰，穩(wěn)定期、衰亡期的轉(zhuǎn)錄水平與各生長(zhǎng)期間均存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)，而在CY1201菌株生長(zhǎng)過程中穩(wěn)定期達(dá)到高峰，各生長(zhǎng)期間無顯著性差異(P>0.05)，且生長(zhǎng)過程中sRNA145的轉(zhuǎn)錄水平在衰亡期時(shí)YK1603菌株與CY1201菌株呈現(xiàn)約15倍顯著差異(P<0.05)(圖5)。

2.5 副豬嗜血桿菌YK1603、CY1201菌株感染PK-15細(xì)胞后sRNA64和sRNA145轉(zhuǎn)錄分析

sRNA64在YK1603菌株感染細(xì)胞后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，9 h、48 h的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于0 h(P<0.05)，在CY1201菌株感染細(xì)胞后不同時(shí)間段均上調(diào)表達(dá)，9 h的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于0 h(P<0.05)，24 h、48 h的轉(zhuǎn)錄水平與9 h間呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，與0 h無顯著性差異(P> 0.05)，感染細(xì)胞后sRNA64轉(zhuǎn)錄水平在9 h時(shí)YK1603菌株與CY1201菌株呈現(xiàn)約10倍極顯著差異(P<0.01)(圖6)；sRNA145在YK1603菌株感染細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P> 0.05)，在CY1201菌株感染細(xì)胞后9 h的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于0 h(P<0.05)，24 h與0 h的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，與48 h呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05),兩種血清型的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)表達(dá)，在各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P> 0.05)(圖7)。

A：YK1603菌株; B：CY1201菌株。a.遲緩期; b.指數(shù)期; c.穩(wěn)定期; d.衰亡期; 表示兩者的t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*.P<0.05; **.P<0.01)

A：YK1603菌株; B：CY1201菌株。a.遲緩期; b.指數(shù)期; c.穩(wěn)定期; d.衰亡期; 兩者的t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*.P<0.05; **.P<0.01)

A：YK1603菌株; B：CY1201菌株。a.0 h; b.9 h; c.24 h; d.48 h; 表示兩者的t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*,P<0.05; **,P<0.01)

3 討 論

隨著對(duì)非編碼小RNA的探索，逐漸揭示了其在細(xì)菌生命活動(dòng)中扮演著重要角色。已經(jīng)在大腸埃希氏菌[8]、金黃色葡萄球菌[9]、沙門氏菌[10]、布魯氏菌[11]等細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了sRNA，并證明了sRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與細(xì)菌抵御環(huán)境應(yīng)激密切相關(guān)[11-12]，對(duì)于副豬嗜血桿菌相關(guān)sRNA的研究還未有報(bào)道。本研究中，sRNA64的轉(zhuǎn)錄水平在YK1603菌株體外不同生長(zhǎng)期與感染細(xì)胞后趨勢(shì)相反，而在CY1201菌株中大致相同且差異表達(dá)。sRNA145的轉(zhuǎn)錄水平在YK1603菌株體外不同生長(zhǎng)期與感染細(xì)胞后逐漸呈上調(diào)趨勢(shì)，體外不同生長(zhǎng)期差異表達(dá)，在CY1201菌株體外不同生長(zhǎng)期與感染細(xì)胞后趨勢(shì)大致相同但在后者中差異表達(dá)。推測(cè)sRNA64、sRNA145可能分別與CY1201、YK1603菌株適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激有關(guān)，同時(shí)sRNA64可能在YK1603、CY1201菌株急性感染階段發(fā)揮作用，sRNA145可能在YK1603、CY1201菌株慢性感染階段發(fā)揮作用。

A：YK1603菌株; B：CY1201菌株。 a.0 h; b.9 h; c.24 h; d.48 h; 表示兩者的t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*,P<0.05; **,P<0.01)A：YK1603 strain; B：CY1201 strain. a.0 h; b.9 h; c.24 h; d.48 h; The difference of t test between the two groups is statistically significant (*,P<0.05; **,P<0.01)

當(dāng)前已鑒定的副豬嗜血桿菌毒力相關(guān)因子包括脂寡糖[13]、外膜蛋白[14]、細(xì)胞致死性膨脹毒素[15]、莢膜和生物被膜[16-17]、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白[18]、神經(jīng)氨酸酶[19]等。而sRNA作為一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子，在李斯特桿菌[20]、鏈球菌[21]等研究中發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的sRNA與細(xì)菌毒力相關(guān)，同時(shí)受靶基因的調(diào)控[22]。本研究中sRNA64在強(qiáng)毒株中呈現(xiàn)不同時(shí)間段轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)(P<0.05)，而在弱毒株中顯著下調(diào)(P<0.05)，同時(shí)sRNA64的轉(zhuǎn)錄水平與弱毒株感染時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)sRNA64直接參與調(diào)控弱毒株發(fā)揮作用，在強(qiáng)毒株中可能會(huì)抑制或激活某個(gè)途徑來影響其調(diào)控的能力。sRNA145雖然在強(qiáng)毒株中差異表達(dá)，但是在各時(shí)間點(diǎn)不同毒力中轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)差異不大(P>0.05)，推測(cè)sRNA145與毒力不相關(guān)，可能受其他因素的調(diào)控導(dǎo)致sRNA145在HPS強(qiáng)毒株感染時(shí)期發(fā)揮作用。

細(xì)菌侵入宿主體內(nèi)后，在體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育繁殖受多種因素的調(diào)控，而sRNA可以調(diào)控細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵襲以及在胞內(nèi)生存繁殖能力[23,24]。比如sRNA-EsR240可通過調(diào)控靶基因影響愛德華菌胞內(nèi)生存[25]，sRNA InvS與沙門氏菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲有關(guān)，并受蛋白PrgH的影響[26]，sRNA IhtA在衣原體感染細(xì)胞時(shí)期調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[27]。本研究中YK1603菌株在不同的感染時(shí)間sRNA64的轉(zhuǎn)錄水平存在差異性，而CY1201菌株在不同的感染時(shí)間sRNA64和sRNA145的轉(zhuǎn)錄水平均存在差異性，這可能與sRNA調(diào)控HPS對(duì)細(xì)胞的侵襲以及胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的作用有關(guān)。

本研究通過對(duì)2株副豬嗜血桿菌遼寧分離株體外不同生長(zhǎng)期與感染細(xì)胞后sRNA64和sRNA145的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，確定sRNA64和sRNA145是差異表達(dá)基因且對(duì)調(diào)控HPS具有重要意義，但是其具體功能仍需進(jìn)一步研究。