李小鳳，謝芝勛，范 晴，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思，李 孟，鄧顯文

(廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001)

白細胞介素2(lnterleukin-2，IL-2)是Ⅰ型細胞因子家族的一員，最初被稱為T淋巴細胞生長因子，具有廣泛的生物學活性，在機體免疫過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。IL-2能促進CD4+和CD8+T淋巴細胞增殖，增強自然殺傷細胞(NK細胞)和單核細胞等的殺傷活性[4-5]。以IL-2作為免疫佐劑，與人乳頭病毒(HPV)疫苗共同使用可提高疫苗的免疫效果[6]。在體內(nèi)，IL-2因子增強牛對乳房炎[7]、結(jié)核病[8]和皰疹病毒感染[9]的抵抗力，提高了機體的抗病毒功能。過表達IL-2蛋白，可以降低雞新城疫病毒載量[10]和提高對人乳腺癌細胞的殺傷力[11]。可見，IL-2在疾病的防治中發(fā)揮著重要作用。

基于IL-2的重要功能，人和多種哺乳動物的IL-2相繼在體外成功表達[12-14]，并作為商品化藥物廣泛應用于疾病治療。水牛在廣西有重要的經(jīng)濟地位，近年來規(guī)?；B(yǎng)殖增加，一些縣市對養(yǎng)牛業(yè)非常重視，由病毒感染引起的牛病毒性傳染病綜合防控存在短板，新藥的研發(fā)有待突破。因此，對水牛IL-2的研究具有很高實用價值。本研究旨在體外表達水牛IL-2，以期為研發(fā)重組水牛IL-2治療性生物制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、病毒及細胞 水牛新鮮脾臟采自廣西南寧某屠宰場；牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛腎細胞(MDBK細胞)由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑TRIzol試劑盒、IL-2山羊源多克隆抗體，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD-18T載體、T4 DNA連接酶、Hind Ⅲ與BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；牛脾臟淋巴細胞分離液試劑盒、pET-32a(+)載體、刀豆蛋白A (concanavalin A，ConA)、10孔蛋白電泳預制膠、DAB顯色液，北京索萊寶科技公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌DH5α與BL21感受態(tài)細胞，北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品；His標記小鼠源單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L)、HRP標記驢抗山羊IgG(H+L)，武漢三鷹技術(shù)公司產(chǎn)品；His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)，北京康為世紀公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 微量核酸測定儀(NanoDrop 2000)，賽默飛世爾公司產(chǎn)品；凝膠成像分析儀(Gel DocTM XR+)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；潔凈工作臺(DL-CJ-1ND-Ⅱ)，北京東聯(lián)哈爾儀器公司產(chǎn)品；振蕩培養(yǎng)箱(MQT-60R)，上海旻泉儀器公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡(ECLIPSETi2-U)，日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考GenBank上已公布的水牛IL-2編碼區(qū)序列(登錄號 AF363786.1)，使用Oligo 7.37進行引物設計，上、下游引物分別添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點和保護堿基，上游引物為：ATAGGATCCTCAACTCCTGCCACAATGTAC(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點)，下游引物為：ATAAAGCTTAGTCATTGTTGAGTAGATGCTT(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點)，擴增產(chǎn)物長度500 bp。引物由廣州睿博公司進行合成，用于IL-2基因編碼區(qū)擴增。

1.2.2 水牛脾淋巴細胞培養(yǎng) 參照牛脾淋巴細胞分離試劑盒說明書進行水牛脾淋巴細胞提取，得到的淋巴細胞懸液用DMEM培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為2×106個/mL，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)6 h，20 mL DMEM培養(yǎng)基添加10 μg/μL的 ConA 40 μL，置CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育18 h，收集淋巴細胞。

1.2.3 RNA的抽提與IL-2編碼區(qū)基因的擴增 參照Trizol試劑盒說明書提取上述細胞總RNA，并用NanoDrop2000測定核酸濃度，參照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。

以cDNA為模板，PCR擴增IL-2編碼區(qū)基因片段，總反應體系為50 μL：2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/L)，cDNA模板4 μL，無核酸酶水補足至50 μL。反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，34個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，雙酶切鑒定，將正確陽性重組質(zhì)粒送華大公司測序，用NCBI的Blast程序比對，DNAMan 軟件預測IL-2基因所編碼的氨基酸序列，T-IL-2質(zhì)粒于-20℃保存。

1.2.4 表達載體的構(gòu)建 pET-32a載體與T-IL-2質(zhì)粒同時用Hind Ⅲ與BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶于37℃雙酶切6 h，切膠回收酶切產(chǎn)物，將二者于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)過PCR及測序驗證，篩選插入完全正確的陽性菌。

1.2.5 目的蛋白誘導表達與可溶性分析 挑取陽性菌于37℃搖床過夜培養(yǎng)作為種子液，次日按1%接種量接種，培養(yǎng)4 h后加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)6 h。收集誘導后的50 mL菌液，4 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，加入細菌裂解液與PMSF，重懸菌體，超聲破碎菌體至液體呈清亮，分別取混合液(總蛋白)、離心后的上清(可溶性蛋白)、沉淀(不溶性蛋白)樣品進行SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍染色，脫色后用蛋白凝膠成像分析儀進行拍照分析。

1.2.6 重組IL-2蛋白的純化 用His標簽蛋白純化試劑盒進行目的蛋白純化。待上樣平衡后，使用咪唑濃度分別為50、80、100、120、150、180、200、220、250、300和500 mmol/L洗脫液進行洗脫，收集各組流出的洗脫液，經(jīng)NanoDrop2000測定蛋白濃度并選取后面9個濃度的洗脫液進行SDS-PAGE分析。正式的洗脫步驟為：先用50 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，220 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，目的蛋白經(jīng)超濾分子篩濃縮后將原來的buffer換成PBS。

1.2.7 重組蛋白Western blot鑒定 蛋白樣品進行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉4 h，分別加入1∶5 000稀釋的His標記小鼠單克隆抗體，0.1 μg/mL濃度的IL-2山羊源多克隆抗體，于4℃孵育過夜，次日PBST洗膜4次，再分別加入1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗鼠二抗或1∶5 000稀釋的HRP標記驢抗羊的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜4次，DAB增強型試劑顯色拍照。

1.2.8 IL-2抗病毒活性分析 使用細胞病變抑制法測定重組IL-2蛋白是否具備抗病毒活性。待24孔細胞培養(yǎng)板的MDBK細胞長至單層，IL-2處理組加入含終濃度為3 mg/mL重組蛋白的DMEM共同孵育24 h，次日棄培養(yǎng)液，每孔加入100 TCID50的BVDV溶液；病毒處理組只加100 TCID50的BVDV溶液；未處理組為正常MDBK細胞，不加IL-2與BVDV，72 h后鏡檢細胞病變情況。

2 結(jié)果

2.1 水牛IL-2基因的擴增及克隆產(chǎn)物的鑒定

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離可見大小約為500 bp的條帶，與預期大小相符(圖1)。序列分析顯示，克隆的水牛IL-2基因ORF長468 bp，共編碼155個氨基酸，與GenBank報道的印度水牛IL-2基因(登錄號AF363786.1)核苷酸序列同源性為100%。

2.2 表達載體的構(gòu)建

重組表達質(zhì)粒pET-32a-IL-2的單菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離可見約1 200 bp條帶(目的片斷500 bp，加上載體測序引物擴增產(chǎn)物700 bp)，與預期結(jié)果相符(圖2)。測序結(jié)果顯示插入的IL-2基因大小、位置、閱碼框架均正確，表明pET-32a-IL-2表達載體構(gòu)建成功。

M.DNA標準DL 1 000；1.IL-2 基因擴增產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA標準 DL 2 000；1～4.分別為挑選的不同pET-32a- IL-2菌落PCR

2.3 水牛IL-2蛋白的誘導表達與表達形式分析

水牛IL-2基因編碼區(qū)序列共編碼155個氨基酸，分子質(zhì)量約為17 ku，連接到表達載體pET-32a用IPTG誘導表達。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，重組的IL-2蛋白在大腸埃希氏菌內(nèi)表達較好，融合蛋白約為36 ku(包括標簽蛋白在內(nèi))，重組蛋白主要以可溶性形式表達在上清，即為可溶性蛋白(圖3)。

2.4 IL-2蛋白的純化

重組IL-2 蛋白經(jīng)純化后，SDS-PAGE分析可見單一條帶，可見得到純度較高的IL-2重組蛋白(圖4)。

2.5 重組蛋白Western blot鑒定

分別使用His標記單克隆抗體與山羊IL-2多克隆抗體行Western blot鑒定，在36 ku處有一特異條帶，而對照空載體在此處沒有出現(xiàn)相應條帶，表明重組水牛IL-2蛋白反應原性良好，均能與His標簽蛋白抗體和IL-2多克隆抗體發(fā)生特異性反應(圖5A和圖5B)。

M.蛋白分子量標準(15～130 ku)；1.pET-32a空載體；2.pET-32a-IL-2載體(未誘導)；3.pET-32a-IL-2載體(總蛋白)；4.可溶性蛋白；5.不溶性蛋白

M.蛋白Marker(11～245 ku)；1.pET-32a空載體；2.pET-32a-IL-2載體；3.純化后的IL-2

2.6 重組蛋白的抗病毒活性分析

采用BVDV/MDBK細胞病變抑制評估純化的IL-2抗病毒活性。結(jié)果顯示，72 h后，處理組細胞出現(xiàn)典型的細胞病變，萎縮，空斑，脫落；IL-2處理組的細胞與未處理組相比，細胞出現(xiàn)少量病變，密度降低，存活的細胞邊緣整齊、圓滑，可見純化后的IL-2蛋白具有較好的抗病毒活性(圖6)。

A.His標簽抗體；M1.蛋白 Marker(11～245 ku)；1.pET-32a空載體；2.pET-32a-IL-2載體；B.IL-2多克隆抗體；M2.蛋白Marker(15～130 ku)；1.pET-32a空載體；2.pET-32a-IL-2載體

A.未處理組；B.病毒處理組；C.IL-2處理組A.Untreated group；B.Virus treatment group；C.IL-2 treatment group

3 討論

水牛養(yǎng)殖業(yè)在廣西發(fā)展迅速，流行性疾病的盛行必須引起重視，新型抗病毒藥物的研發(fā)迫在眉睫。IL-2是一種對機體免疫應答和抗病毒感染有重要作用的細胞因子，獲得具有活性的重組IL-2蛋白是實驗基礎。本試驗通過原核表達載體pET-32a表達了水牛IL-2重組蛋白，目的蛋白主要以可溶性形式表達在上清，相比于包涵體蛋白，可溶性蛋白更好的保持了天然的活性，Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)IL-2能與His標記單克隆抗體、IL-2多克隆抗體反應，表明IL-2重組蛋白具有良好的反應原性。

IL-2在牛感染性疾病中展現(xiàn)了較好的應用前景。IL-2因子增強牛對乳房炎[7]、結(jié)核病[8]、皰疹病毒感染[9]的抵抗力。同時，IL-2在牛機體內(nèi)的分泌水平高低反映牛感染分枝桿菌的不同狀態(tài)[15]。此外，以IL-2作為免疫佐劑達到增強疫苗的使用效果，Mingala等[16]給水牛注射口蹄疫滅活疫苗后，監(jiān)測體內(nèi)細胞因子的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)IL-2在第2周達到峰值，暗示了IL-2與疫苗相互作用來影響抗病毒的過程；Wyckoff等[17]在感染布魯桿菌牛身上同時使用重組牛IL-2蛋白與疫苗，牛機體的免疫應答增強，提高對布魯桿菌的抵御能力。本試驗在細胞水平上，將原核表達的IL-2蛋白經(jīng)純化、濃縮、置換緩沖液，與細胞培養(yǎng)液混勻作用于感染BVDV的MDBK細胞上；結(jié)果顯示，IL-2蛋白具有抗BVDV對MDBK的作用。其中牛病毒性腹瀉病毒呈世界性分布，感染后牛出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、流產(chǎn)、死胎及畸形胎等癥狀，是影響牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，新的抗病毒藥物研發(fā)是做好疾病防控的重要手段。

IL-2是一種細胞因子，在抗病毒方面的應用相較于獸藥、抗生素等其他藥物優(yōu)勢在于對環(huán)境污染少、無殘留，對流行性疾病的防治、生態(tài)環(huán)保的養(yǎng)殖有重要意義，其更多應用有待于研究者進一步探索。