王玉龍，滕文彬，單 躍，姚劉旭，何 銳，李玉紅，祝勝美*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 浙江 杭州 310000； 2.紹興市人民醫(yī)院 麻醉科，浙江 紹興 312000；3.樹(shù)人大學(xué)樹(shù)蘭國(guó)際醫(yī)學(xué)院附屬樹(shù)蘭(杭州)醫(yī)院 麻醉科， 浙江 杭州 310004)

膿毒癥(sepsis)是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]，是一個(gè)公認(rèn)的全球健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命安全。2017年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，sepsis年發(fā)病例4 890萬(wàn)例，死亡病例約110萬(wàn)例，死亡率為19.7%；拯救sepsis運(yùn)動(dòng)指南為臨床管理sepsis患者提供一些列循證醫(yī)學(xué)建議，在sepsis發(fā)病機(jī)制方面仍然存在很多認(rèn)識(shí)空白[3]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是人體對(duì)適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在急性低氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。近年來(lái)，腸功能障礙對(duì)sepsis結(jié)局的影響受到研究者重點(diǎn)關(guān)注。Sepsis早期腸上皮細(xì)胞低氧能量障礙是腸功能障礙重要誘因，機(jī)體可能通過(guò)上調(diào)HIF-1α，促進(jìn)能量代謝，改善膿毒性腸道黏膜屏障(intestinal mucosal barrier,IMB)損傷，二甲基乙二?；拾彼?dimethyloxallyl glycine, DMOG)是脯氨酰羥化酶的抑制劑，可以抑制脯氨酰羥化酶從而上調(diào)HIF-1α表達(dá)；而拮抗劑BAY87-2243作用相反，下調(diào)HIF-1α表達(dá)。本研究旨在探索HIF-1α激動(dòng)劑DMOG或拮抗劑BAY87-2243對(duì)膿毒癥大鼠腸道黏膜通透性作用。為sepsis腸道黏膜屏障功能損傷救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，200～250 g[浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK (浙)2-14-0001]。研究方案經(jīng)過(guò)紹興市人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)議討論通過(guò)(倫理審批文號(hào)：2020-009)。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備：二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白2(intestinal type fatty acid binding protein 2, I-FABP/FABP2)試劑盒(Cloud-Clone公司)；D-乳酸(D-lactic)試劑盒(Abebio公司)；熒光素標(biāo)記的右旋糖苷(fluorescein isothiocyanate-dextran, FD4)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich公司)； HIF-1α、ZO-1(zonula occludens-1)、occludin、claudin-1和GAPDH一抗(Abcam公司)；二甲基乙二?；拾彼?dimethyloxaloylglycine,DMOG)和BAY87-2243(MedChemExpress公司)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson公司)。SpectraMax Plus全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)和Quantity one 4.6圖像處理與分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；R510IP小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理：將大鼠隨機(jī)數(shù)字法分為sham組(n=6)、sepsis組(n=6)[用盲腸結(jié)扎穿孔(ligation and perforation, CLP)]、(sepsis+DMOG)組(n=6)[CLP術(shù)前連續(xù)7 d腹腔注射DMOG(40 mg/kg)]；(sepsis+BAY87-2243)組(n=6)[CLP術(shù)前連續(xù)3 d灌胃BAY87-2243(9 mg/kg)]。

1.2.2 標(biāo)本的采集與處置：大鼠采用七氟烷麻醉后，分離出4 cm小腸，用手術(shù)縫線分別結(jié)扎腸管兩端，將50 μg的FD4，藥物配制濃度為100 mg/mL，注入腸管內(nèi)，1 h后取門(mén)靜脈0.5 mL，用于測(cè)定FD4血漿濃度。之后取腹主動(dòng)脈血2 mL，低溫離心后分裝置于-80 ℃保存，用于檢測(cè)DAO、FABP2、D-lactic血漿濃度。距離盲腸部2 cm處取1 cm回腸組織數(shù)段，部分制成蠟塊用于形態(tài)學(xué)研究；部分分裝置于-80 ℃存儲(chǔ)，用于檢測(cè)腸黏膜緊密連接(tight junctions, TJs)和HIF-1α蛋白的表達(dá)。隨后頸椎脫臼法處死大鼠。

1.2.3 HE染色檢測(cè)大鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)變化：常規(guī)HE染色光鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變，采用Chiu’s 評(píng)分定量判定小腸組織損傷程度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)DAO、FABP2和D-lactic血漿濃度：按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各標(biāo)本DAO、FABP2和D-lactic血漿表達(dá)水平。每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獲得酶標(biāo)儀450 nm處吸光值(A)，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本DAO、FABP2和D-lactic的含量，取平均值。

1.2.5 FD4濃度的測(cè)定：解凍后血漿作1∶8倍稀釋?zhuān)D(zhuǎn)移到96孔板，每個(gè)標(biāo)本做個(gè)復(fù)孔，每個(gè)孔100 μL。用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定FD4血漿濃度。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定為490 nm和520 nm。

1.2.6 Western blot測(cè)定小腸黏膜TJs和HIF-1α蛋白的表達(dá)： 具體操作步驟按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)sepsis大鼠腸黏膜病理形態(tài)的影響

Sham組大鼠腸黏膜完整，絨毛整齊(圖1A)；Sepsis組膜黏膜完整性破壞，腸絨毛萎縮脫落；(sepsis+DMOG)組大鼠腸絨損傷程度介于sham組和sepsis組之間；而(sepsis+BAY87-2243)組絨毛損傷比sepsis組更嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)潰瘍。Chiu’s評(píng)分與黏膜損傷程度成正比，具體見(jiàn)圖1A，B。

2.2 各組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿的比較

與sham組相比，sepsis組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿濃度均增高(P<0.05)(圖2A～D)。與sepsis相比，(sepsis+DMOG)組DAO、FABP2、D-lactic和FD4血漿濃度均明顯降低(P<0.05)(圖2A～D)；(sepsis+BAY87-2243)組大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD-4血漿濃度均顯著升高(P<0.05)(圖2A，D)。

2.3 各組大鼠腸黏膜組織TJs和HIF-1α表達(dá)的比較

與sham組相比，sepsis組大鼠腸黏膜組織中HIF-1α的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)(圖3A，B)，而TJs蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1蛋白)的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)(圖3A，C～E)。與sepsis相比(sepsis+DMOG)組腸黏膜組織中HIF-1α、ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)P<0.05)；而(sepsis+BAY87-2243)組相反，腸黏膜組織中上述蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)(圖3,表1)。

表1 HIF-1α激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)大鼠腸黏膜HIF-1α和TJs蛋白表達(dá)的影響

A.images of intestinal morphology, the pathological status of intestinal mucosal barrier villi and lamina propria in the treated animals was shown at the arrow (HE staining,×200); B.intestinal mucosa injury was quantitative assessed by Chiu’s Score; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group圖2 HIF-1α激動(dòng)劑或抑制劑對(duì)大鼠血漿DAO(A)、FABP2(B)、D-lactic(C)和FD4(D)的影響

3 討論

Sepsis是一種危及生命的臨床綜合征，可導(dǎo)致自身組織和器官損傷，引起多個(gè)器官功能障礙[1]。危重患者腸道致病菌過(guò)度繁殖，腸黏膜受損，細(xì)菌毒素進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)而發(fā)展為全身性炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，因此，腸道是sepsis的“啟動(dòng)器官”。Sepsis中，腸黏膜微循環(huán)障礙，腸道黏膜屏障受損；通過(guò)腸道-淋巴通路使腸功能衰竭進(jìn)一步惡化，腸道又是sepsis的“中心器官”[5]。

DAO和FABP2在腸黏膜細(xì)胞中表達(dá)， 腸黏膜損傷細(xì)胞脫落時(shí)，快速釋放進(jìn)入血循環(huán)，可以作為腸黏膜損傷的特異性標(biāo)志物[6]。D-lactic是腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物， 腸黏膜損傷致通透性增加時(shí)，D-lactic入血，哺乳動(dòng)物不能代謝D-lactic，因此，血D-lactic濃度增加間接反映腸道通透性增加[6]。FD4是腸道通透性和腸道屏障改變的標(biāo)志物[7]。本研究中，sepsis大鼠上述血漿標(biāo)志物均升高，提示sepsis導(dǎo)致大鼠腸黏膜損傷，通透性增加。

TJs是維系細(xì)胞間鏈接與細(xì)胞屏障的重要組成部分。Occludin維持腸道物理特性，具有黏附功能；claudin-1形成細(xì)胞旁離子的選擇性通道，影響著細(xì)胞間物質(zhì)滲透率[8]；ZO-1與多種細(xì)胞骨架蛋白綁定，對(duì)TJs起到支撐骨架作用[9]。本研究中，sepsis大鼠腸黏膜組織中TJs相關(guān)蛋白ZO-1、occluden、claudin-1的表達(dá)水平下降，病理形態(tài)破壞，提示sepsis導(dǎo)致大鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞。

生理狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞暴露于“生理性低氧”環(huán)境中，低氧環(huán)境是腸道共生菌生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，并促進(jìn)腸道物質(zhì)運(yùn)輸[10]；炎性反應(yīng)時(shí)，氧耗增加、血管收縮導(dǎo)致氧供降低，腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)缺氧[11]。本研究中，sepsis大鼠腸黏膜中HIF-1α表達(dá)明顯增加，明顯高于正常組，提示sepsis造成腸黏膜細(xì)胞缺氧，黏膜細(xì)胞通過(guò)自身代償性HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，以提高對(duì)缺氧的耐受并促進(jìn)增殖維護(hù)腸道黏膜屏障的完整。既往研究使用HIF-1α激活劑明顯減輕CLP引起小鼠腎臟損害[12]。在結(jié)腸炎小鼠中，HIF-1α激活劑AKB-4924能增強(qiáng)小鼠腸黏膜屏障功能，但是對(duì)HIF-1α缺陷小鼠無(wú)腸黏膜保護(hù)作用，表明腸黏膜HIF-1α是AKB-4924介導(dǎo)保護(hù)的組織靶點(diǎn)[13]。腸道HIF-1α敲除小鼠加劇腸酒精性腸道黏膜屏障的破壞[14]。通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF在基因啟動(dòng)子水平上對(duì)claudin-1的表達(dá)起著基本的調(diào)節(jié)作用，揭示claudin-1可能是HIF的一個(gè)重要靶基因，HIF缺陷型腸黏膜claudin-1表達(dá)異常，導(dǎo)致TJs形態(tài)異常[15]。本研究中給予sepsis大鼠DMOG，sepsis大鼠腸道HIF-1α和TJs相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，腸道黏膜損傷緩解。而給予BAY87-2243，出現(xiàn)HIF-1α和TJs相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，腸黏膜損傷緩解加重。

A.expression bands; B-E.protein expression of HIF-1α, ZO-1, occudin, and claudin-1; *P<0.05 compared with sham; #P<0.05 compared with sepsis

綜上所述，sepsis時(shí)大鼠腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞，黏膜細(xì)胞通過(guò)自身調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)上調(diào)。給予HIF-1α激動(dòng)劑DMOG通過(guò)降低腸黏膜通透性，調(diào)節(jié)TJs中claudin-1而發(fā)揮保護(hù)腸道黏膜屏障作用，緩解膿毒引起的腸道黏膜屏障損傷作用；而給予HIF-1α抑制劑BAY87-2243，作用相反。結(jié)果提示HIF-1α對(duì)sepsis大鼠通過(guò)降低腸黏膜的通透性，發(fā)揮對(duì)膿毒癥腸黏膜損傷具有保護(hù)作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。