李 麗，臧真榮，燕麗萍，王因花，吳德軍

（山東省林業(yè)科學研究院山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東濟南250014）

自然環(huán)境中非生物脅迫比如鹽堿、干旱、低溫等會影響植物的正常生長，植物往往通過抗逆相關基因的表達并經(jīng)過體內(nèi)一系列復雜的生理生化反應來抵御和適應外界環(huán)境的變化[1-2]，因此抗逆基因的表達是植物抵御外界不利因素、增強自身適應性的關鍵所在。許多研究證實植物抗逆基因的表達受某些鋅指蛋白調(diào)控，且鋅指蛋白發(fā)揮著重要作用[3]。因此可通過構(gòu)建逆境相關鋅指蛋白基因的植物表達載體，將基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，使其蛋白產(chǎn)物在逆境脅迫下過表達從而達到從分子水平提高植物抗逆性的目的。鋅指蛋白序列中的組氨酸（His）與半胱氨酸（Cys）能和鋅離子結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)與DNA 雙鏈大溝或蛋白結(jié)合后參與基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。TFIIIA 是首次發(fā)現(xiàn)的具有此功能的鋅指蛋白[4]，隨后人們發(fā)現(xiàn)各種動植物或其他物種體內(nèi)存在鋅指蛋白。根據(jù)蛋白中半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)的排列順序，鋅指蛋白被分成C2H2、C8、C6、C3HC4（RING 型）、C2HC 等類型[5]。本研究所克隆的鋅指蛋白屬于A20/AN1 型鋅指蛋白，該蛋白具有A20或（和）AN1 型鋅指結(jié)構(gòu)。A20 鋅指由一個或多個串聯(lián)C2C2 鋅指結(jié)構(gòu)組成； AN1 鋅指的結(jié)構(gòu)模式是C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X- C 或者C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X 代表任意氨基酸[6]。OsSAP1（Oryza sativa subspecies indica stress-associated protein1）是在植物中首次發(fā)現(xiàn)的具有AN1 與A20 鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，在煙草中過量表達OsSAP1 后，轉(zhuǎn)基因煙草對逆境的耐受性得以提高[7]。后來有更多研究證明非生物脅迫應答與A20/AN1 鋅指蛋白相關，因此具有A20/AN1 結(jié)構(gòu)的蛋白被研究者命名為逆境相關蛋白SAPs（Stress associated proteins）[8]。

絨毛白蠟（Fraxinus velutina Torr.）為木樨科（Oleacear）白蠟屬（Fraxinus L.）植物，原產(chǎn)美國，其樹體高大，根系發(fā)達，抗逆性強，是鹽堿地造林的主要樹種，在城市綠化中應用也非常廣泛。本研究以絨毛白蠟為材料，通過RT-PCR 技術(shù)克隆了含有兩個AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白FvSAP1 并對該基因以及編碼的氨基酸序列進行了生物信息學分析，同時構(gòu)建了pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表達載體，為下一步分析非生物脅迫下轉(zhuǎn)FvSAP1 基因的株系與非轉(zhuǎn)基因株系之間的表達差異，進而培育抗性強的絨毛白蠟新品種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年在山東省林木遺傳改良重點實驗室進行，以絨毛白蠟(Fraxinus velutina Torr.) R36 的種子組培幼苗為材料。R36 為項目組在種質(zhì)資源收集過程中于山東省東營市發(fā)現(xiàn)的優(yōu)株。

1.2 絨毛白蠟總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

總RNA 提取采用Trizol 法，測定其OD260/OD280 值。取5 μL 樣品，加1 μL 6×Loading buffer，用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量。用提取的總RNA 作為模板，按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 使用說明書合成的cDNA 第一鏈。

1.3 克隆絨毛白蠟FvSAP1 基因編碼區(qū)

以絨毛白蠟轉(zhuǎn)錄組Unigene 數(shù)據(jù)為基礎，該數(shù)據(jù)通過Illumina HiSeq 2000 高通量測序技術(shù)獲得。設計引物序列如下F2:5′-CGGAAATGGGGAAGAACAG-3′; R2:5′-CAAACAAGAGGTCCGTCAT-3′，以F5、R5 為引物，cDNA 為模板，使用高保真酶對引物中間的蛋白質(zhì)編碼框進行擴增。擴增條件為：先94℃預變性5 min；再94℃變性30 s； 然后58℃退火30 s；最后72℃延伸1 min 30 s，共計30 個循環(huán)。把擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測完畢將目的條帶回收、連接pMD18-T Vector 并把重組載體pMD18-T-FvSAP1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)過過夜培養(yǎng)后，選取單菌落進行PCR 擴增并篩選陽性克隆，在檢測結(jié)果為陽性的菌液中加入15%的甘油在-80℃條件下保存，同時將新鮮菌液送到山東沃恩生物科技有限公司進行測序。

1.4 絨毛白蠟pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表達載體的構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒pMD18-T-FvSAP1，使用Xba I 和Sal I 對pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 質(zhì)粒進行雙酶切，凝膠電泳檢測目的條帶并回收。使用T4 DNA 連接酶將回收的目的基因和線性pCAMBIA2300 載體進行連接，將連接后的重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-FvSAP1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。過夜培養(yǎng)后選取單菌落進行PCR 擴增篩選陽性菌落。

1.5 生物信息學分析

利用ORFfinder 程序?qū)ふ议_放閱讀框； NCBI 上的CD-Search 工具查找氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；BLASTX 程序進行核苷酸序列及其推導的氨基酸序列同源性比對； DNAMAN 軟件進行氨基酸序列的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 絨毛白蠟FvSAP1 基因編碼區(qū)的克隆及植物表達載體的構(gòu)建

本實驗以絨毛白蠟幼嫩葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，通過設計特異性引物F2/R2 擴增得到大小為900bp左右的預期條帶（見圖1-A），對該條帶進行回收、轉(zhuǎn)化、陽性檢測（見圖1-B）、保菌并測序。

圖1 PCR 擴增結(jié)果

對pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 質(zhì)粒進行雙酶切并使用T4 DNA 連接酶將目的基因與線性載體連接獲得重組pCAMBIA2300-FvSAP1 質(zhì)粒，且將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 獲得重組質(zhì)粒菌株。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 氨基酸序列分析

基因編碼區(qū)編碼281 個氨基酸，分子量為31.0 kDa，等電點為8.34。使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 上的Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫查詢FvSAP1 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)顯示在13-47bp 和101-137bp 處各有1 個AN1 型鋅指結(jié)構(gòu)（見圖2），其結(jié)構(gòu)為：C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C。Jin 等把水稻、白楊等4 種植物中含AN1 鋅指的蛋白家族分為兩大類：類型Ⅰ的AN1 鋅指基序為CX（2）CX（9-12）CX（1-2）CX（4）CX（2）HX（5）HXC，通常還含有A20 鋅指結(jié)構(gòu)域，基因內(nèi)無內(nèi)含子；類型II的鋅指基序為CX（4）CX（9-12）CX（1-2）CX（4）CX（2）H X（5）HXC，不含A20 結(jié)構(gòu)域，基因內(nèi)有內(nèi)含子[9]。說明所克隆的基因?qū)儆陬愋虸I。

圖2 FvSAP1 基因編碼區(qū)序列及氨基酸序列

2.2.2 同源性分析

Blast 工具尋找FvSAP1氨基酸序列的同源序列，結(jié)果顯示與包含AN1 和C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白序列有較高的相似性。其中與芝麻(Sesamum indicum, XP_011075237.1) SiSAP16 序列的相似性為78%； 與煙草(Nicotiana attenuata, OIT39519.1)NaSAP16 序列的相似性為75%。選取相似性較高的幾個序列以及查閱相關文獻得知，同類的與抗逆境脅迫相關的蛋白番茄SlSAP12(Solanum lycopersicum,FJ442198)[10]，擬南芥AtSAP11(Arabidopsis thaliana, Q8VZ42)[11]，玉米ZmAN110(Zea mays, EF396223)進行多重序列比對（見圖3）。從圖中可以看出N-端的兩個AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域和C-端功能未知，類似C2H2 鋅指的區(qū)域存在較高的保守性，說明不同物種之間，該蛋白序列的具有較高的保守性。

圖3 FvSAP1 與同類蛋白的多重序列比對

3 結(jié)論

鋅指蛋白屬于基因表達調(diào)控因子，其重要作用就是調(diào)控基因的表達。已有多項研究顯示植物體內(nèi)的A20/AN1型鋅指蛋白與植物應對逆境的反應有密切關系，人們將這種蛋白稱為逆境相關蛋白SAPs（Stress associated proteins）。本研究從絨毛白蠟中克隆出了一個鋅指蛋白基因FvSAP1，分析發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白序列中包含兩個AN1型鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于A20/AN1型鋅指蛋白，且與其他植物的同類鋅指蛋白具有高度的保守性，并且構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA2300-FvSAP1，為下一步驗證該基因是否與逆境脅迫應答相關，以及培育優(yōu)良抗性強的絨毛白蠟新品種奠定基礎。