李海蓉，夏九鮮，李建華，郭學(xué)勇，李德勤，張圓嬡

（1.安寧市畜牧獸醫(yī)站，云南安寧 650300；2.昆明市西山區(qū)動物防疫檢疫服務(wù)中心，云南昆明 650100；3.安寧市青龍街道辦生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心 650308；4.安寧市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)督站，云南安寧 650300）

豬附紅細(xì)胞體與奇異變形桿菌的混合感染主要在哺乳類動物和年齡品種各不相同的豬中傳播感染，但相對來說豬發(fā)病是最高的，其他哺乳動物幾乎不發(fā)病?；旌细腥静∏閺?fù)雜，發(fā)病癥狀同其豬瘟等豬的常見病具有相似性，常常被誤診，給治療帶來不便。若診斷不當(dāng)、治療不及時，豬個體短期內(nèi)會發(fā)病病死，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

目前，針對豬附紅細(xì)胞體和奇異變形桿菌的混合感染的研究相對較少，也沒有具體治療方法，在預(yù)防和治愈方面還比較薄弱，導(dǎo)致豬傳染率和病死率都較高。本研究提供了診斷和治療方法，可以適當(dāng)預(yù)防和治療此病，降低傳染率和病死率，為研制相應(yīng)的藥物和疫苗提供了參考。

1 材料與方法

1.1 研究背景

2017年2月7日安寧青龍顧建安養(yǎng)豬場爆發(fā)了一場地方性流行疫病，主要表現(xiàn)為，發(fā)病豬精神萎靡、高熱、黃疸、便秘、可視黏膜蒼白、兩耳腫脹發(fā)紺，最后病死。

1.2 研究材料

樣品為豬場送來的豬全血、豬內(nèi)臟。

試劑為2%去氧膽酸鈉溶液、Trizol Reagent試劑、氯仿、丙醇混合溶劑、75%乙醇溶液、dNTP、蒸餾水、10 × PCR buffer、Taq DNA酶、ddH2O、胰蛋白胨氯化鈉溶液、姬姆薩染色液、瑞氏染色液、吖啶橙染色液、RNase抑制劑和AMV-RT。

培養(yǎng)基為血液瓊脂培養(yǎng)基、鳥氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、氧化酶培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基、脈酶培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、衛(wèi)矛醇培養(yǎng)基、1.5%瓊脂培養(yǎng)基。

試驗器材包括PCR儀、EP試管、離心管、移液槍、離心機(jī)、電泳儀、載玻片、顯微鏡、接種針、消毒牙簽、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋等試驗器材。

1.3 診斷方法

1.3.1 病豬剖檢

對發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，觀察病豬的病變部位及病變程度。

1.3.2 直接鏡檢

取適量發(fā)病豬送檢樣品中的豬全血，滴于載玻片上，并在其中加入等量氯化鈉溶液，然后小心蓋上蓋玻片，壓實。相同步驟制作相同樣品載波片2份以備用，隨機(jī)取制作完成的載波片，在油鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.3 涂片鏡檢

無菌采取正常豬血制作載玻片，作為陰性對照。對豬血進(jìn)行姬姆薩染色、瑞氏染色、吖啶橙染色在顯微鏡下觀察。

1.3.4 RT-PCR檢測

（1）利用病毒核酸提取試劑盒對豬組織樣進(jìn)行病毒核酸的提?。桓鶕?jù)GenBank中登錄的基因，設(shè)計一對引物，預(yù)計PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為602 bp。反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

（2）反應(yīng)步驟為: 94 ℃ 熱變性5 min，94 ℃變性45 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，做30～35個循環(huán)。

（3）PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，運用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察，針對電泳條帶進(jìn)行密度掃描鑒定。電泳檢測cDNA。將制好的凝膠板水平放入電泳槽，將樣品用移液槍加到凝膠孔中，打開電源將電壓調(diào)節(jié)至120 v，電泳25 min。電泳結(jié)束后在成像分析系統(tǒng)觀察凝膠形成的條帶并記錄結(jié)果，見圖1。

圖1 cDNA電泳實驗結(jié)果（1.PCR擴(kuò)增樣品；2.陰性對照）

（4）PCR特異性實驗。用該引物和反應(yīng)條件對豬支原體、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒、偽狂犬病毒等基因組和SPF豬血DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗證PCR的特異性。

（5）臨床樣品檢驗。取豬全血樣品20份，樣品為鮮血涂片鏡檢和臨床癥狀都疑似豬附紅細(xì)胞體感染的，進(jìn)行PCR檢測。重復(fù)檢測結(jié)果為假陰性的樣品。當(dāng)檢測時，將未加DNA模板的反應(yīng)體系分為2份，1份加陰性樣品DNA，1份加陽性樣品DNA作為對照。

1.3.5 細(xì)菌培養(yǎng)鏡檢

在無菌條件下，將肝臟組織取適量接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h，觀察生長狀況。挑取單個長勢良好的菌落進(jìn)行革蘭氏染色并進(jìn)行鏡檢，并富集培養(yǎng)和純化，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)24～48 h，觀察生長狀況。

1.3.6 生化實驗

（1）發(fā)酵實驗。將細(xì)菌培養(yǎng)獲得的菌落用實驗室消毒后的牙簽挑取分別接種到脈酶培養(yǎng)基、氧化酶培養(yǎng)基、賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、衛(wèi)矛醇培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基、鳥氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、以及葡萄糖培養(yǎng)基之上。然后將其置于恒溫37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

（2）動力實驗。取胰蛋白胨的半固體培養(yǎng)試管，用接種針挑取細(xì)菌培養(yǎng)獲得的待測細(xì)菌，垂直半固體瓊脂表面往下插入，在距離培養(yǎng)試管底部還有5 mm左右時垂直抽出接種針，若穿刺線周圍有擴(kuò)散生長，則為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢結(jié)果

解剖后發(fā)現(xiàn)以下幾點病狀，見圖2。

圖2 發(fā)病豬病理解剖圖（a. 內(nèi)臟；b. 腎臟；c.肺；d. 肝臟）

（1）血液顏色為暗紅色且較為稀薄，凝血性下降。

（2）在胸前、腹股等部分的淋巴結(jié)腫大出血，使用手術(shù)刀切割后發(fā)現(xiàn)切面會流出一定量黑紅色的液體，并伴隨有一定的化膿現(xiàn)象。

（3）心臟積液，心肌出血病變；肝臟腫脹出血，呈棕黃色。

（4）腎臟腫脹出血；肺部腫脹出血，偶見血斑塊；腸系水腫出血，有特殊氣味。

2.2 直接鏡檢結(jié)果

在油鏡下觀察使用豬全血制作的玻片，在紅細(xì)胞和血漿中表面附著一些絲狀體或圓形蟲體，紅細(xì)胞形狀變異，多呈星星狀或鋸齒狀，正常形態(tài)的紅細(xì)胞幾乎沒有，見圖3（a）。

2.3 涂片鏡檢結(jié)果

（1）觀察姬姆薩染色后，紅細(xì)胞邊緣變?yōu)殇忼X狀，酷似菠蘿，不再有圓滑表面；形狀殘缺不全，顏色呈淡藍(lán)紫色，見圖3（b）。

（2）瑞氏染色后觀察細(xì)胞相對變大，有一些染色相對較深的顆粒狀物附著于紅細(xì)胞表面或突出部位，見圖3（c）。

（3）在熒光顯微鏡下觀察吖啶橙染色后，紅細(xì)胞多數(shù)變?yōu)榘稻G色，其中并有一些細(xì)小的單體存在，呈現(xiàn)橘黃色，形成強(qiáng)烈對比，見圖3（d）。

圖3 鏡檢結(jié)果圖（a. 血涂片；b. 姬姆薩染色；c. 雄蟲體前部瑞氏染色；d. 吖啶橙染色）

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果表明，僅豬附紅細(xì)胞體血涂片鏡檢為陽性，其他病原檢測結(jié)果均為陰性，見表2。

表2 PCR實驗結(jié)果

2.5 細(xì)菌培養(yǎng)鏡檢結(jié)果

（1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落呈乳白色，有明顯的遷徙生長現(xiàn)象。

（2）麥康凱培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落整體為圓形扁平狀，細(xì)菌半透明，呈黃褐色，同樣在菌落邊緣具有明顯的遷徙生長現(xiàn)象。

（3）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。在37 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，肉湯變得輕度渾濁。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，肉湯培養(yǎng)基中出現(xiàn)了一定量的絮狀沉淀物。

（4）血瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌菌落呈灰白色，平鋪布滿培養(yǎng)基，有溶血現(xiàn)象，并散發(fā)出一股腐敗性臭味。

（5）將該菌置于光學(xué)顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)該菌形態(tài)多樣，部分呈桿狀，部分呈球狀，無芽孢及莢膜。

圖4 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.6 生化實驗結(jié)果

觀察整理細(xì)菌接種培養(yǎng)基實驗結(jié)果，苯丙氨酸脫氨酶陽性，鳥氨酸脫竣酶陽性，脲酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，見表3。

表3 細(xì)菌接種發(fā)酵實驗結(jié)果

觀察該菌動力實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)穿刺線模糊，于側(cè)光條件下可發(fā)現(xiàn)穿刺線周圍有該菌擴(kuò)散生長的痕跡，確定動力實驗為陽性。

3 治 療

3.1 治療方法

（1）血蟲凈（蘭州正豐制藥有限公司生產(chǎn)）。用量3～5 mg/kg，肌內(nèi)注射或者靜脈注射，每天用藥1次，連用3次（三氮脒有一定毒性，使用時注意用法用量）。

（2）長效土霉素（河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。用量0.05 mg/kg，肌內(nèi)注射，每天用藥1次，連用3次。

（3）中藥配方。白術(shù)100 g、干姜50 g、山藥30 g、生姜30 g、大棗30 g、茯苓20 g、車前草10 g混合加水煎煮拌料喂食，每天1次，連續(xù)灌服1周。

3.2 治療結(jié)果

治療3～5 d后，病情得到控制，發(fā)病癥狀緩解，并未見健康豬發(fā)病，豬群進(jìn)食狀況改善，偶見水樣糞便；1周后，無豬感染，發(fā)病癥狀基本消失，豬群進(jìn)食狀況良好，糞便正常。

4 討 論

通過一系列的研究將此次疫病診斷為豬附紅細(xì)胞體和奇異變形桿菌的混合感染，過程嚴(yán)謹(jǐn)并排除實驗錯誤的可能性。附紅細(xì)胞豬體感染與很多疾病的臨床癥狀很相似，因此如果只看臨床癥狀無法確診，必須借助實驗室檢測。相對于附紅細(xì)胞體而言，目前沒有好的體外培養(yǎng)方法，難以鑒定病原體。判斷豬是否感染只能對豬全血樣品涂片染色進(jìn)行鏡檢，但經(jīng)常由于染色劑和一些外在因素的影響，“假陽性”現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)在結(jié)果里，如未成熟紅細(xì)胞的形態(tài)和附紅細(xì)胞體感染后紅細(xì)胞相似，會導(dǎo)致誤判成陽性。

除此之外，鑒定實驗還經(jīng)常用補(bǔ)體結(jié)合實驗，酶聯(lián)免疫吸附實驗，熒光抗體實驗，間接血凝實驗等。但這些實驗診斷經(jīng)常會因為豬感染了附紅細(xì)胞體后，導(dǎo)致免疫力降低，從而影響血清學(xué)實驗結(jié)果。除此之外，病原也無法徹底準(zhǔn)確的被檢測出來。研究時主要采用血涂片鏡檢和RT-PCR進(jìn)行結(jié)合診斷，相對來說，準(zhǔn)確度更高，結(jié)果更可靠。

近年來，對于奇異變形桿菌的感染報道很多在畜牧生產(chǎn)上，但由于對此菌的研究很少，導(dǎo)致預(yù)防和治療都有很多困難，并且此菌有很強(qiáng)的耐藥性和變異性，目前還沒有藥物可以徹底進(jìn)行治療。而且豬附紅細(xì)胞體發(fā)病后，會大大降低豬的抵抗力，細(xì)菌性疾病較容易感染。