張 靜，李 沙，王雪霖，江曉波

（四川省德陽生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 德陽 618000）

隨著工業(yè)化進程的不斷推進，我國環(huán)境監(jiān)測事業(yè)得到迅速發(fā)展。除傳統(tǒng)理化分析外，生物毒性檢查方法，特別是發(fā)光細菌法以其便捷性、全面性在水質連續(xù)自動監(jiān)測、水源地預警監(jiān)測和突發(fā)污染事件應急處理中也得到迅速發(fā)展和廣泛應用。

發(fā)光細菌法是現(xiàn)今判斷生物急性毒性較為成熟的方法?？v觀國內外研究結果，大多數重金屬物質都對發(fā)光細菌有光損失作用，毒物濃度與菌體發(fā)光強度呈線性負相關[1]，本文就毒性物質作用于發(fā)光細菌的時間、反應體系中濃度與光損失變化、相關性曲線的線性范圍等進行了探討。

1 實驗部分

1.1 原理

發(fā)光細菌在有氧條件下通過生化反應產生熒光。當細胞活性升高，發(fā)光強度增強。在毒物作用下，細胞活性下降，發(fā)光強度降低。因此，水質急性毒性的測定結果可以用相對發(fā)光度表示[2]。

1.2 試驗儀器與試劑

（1）儀器：便攜式生物毒性檢測儀，型號UTOX-100，編號UTOX-03040120，廠家：深圳市有為環(huán)境科技有限公司

（2）試劑：明亮發(fā)光桿菌（-20℃以下冷凍保存）、稀釋液、滲透壓調節(jié)液、純水。

（3）標準溶液：汞100 mg/L，銅、鋅1000 mg/L。

（4）實驗設備：移液器100 μl和1 mL、容量瓶100 mL。

1.3 試驗步驟

1.3.1 標準使用液配制

用移液器分別取1 mL汞、銅、鋅標準溶液于100 mL容量瓶中，用純水定容。得使用液濃度：汞1 mg/L，銅、鋅10 mg/L。

1.3.2 有效性試驗

菌種復蘇：從冰箱里取出菌種立即加復蘇稀釋液2.5 mL搖勻，置于室溫（20～25 ℃）平衡15 min后用于測量。

有效性驗證點測定：1號位是空白參照位，儀器默認其相對發(fā)光度為100%，先各試管取100 μL滲透壓調節(jié)液，后取純水和三個標準使用液900 μL，再向各小試管加入50 μL復蘇好的明亮發(fā)光桿菌，混勻，避免產生氣泡影響測定結果。打開溫控模式（20 ℃），設置測量時間15 min，點擊測試。15 min后測得汞、銅、鋅的相對發(fā)光度均低于50%，說明測試有效。

1.3.3 曲線點測定

該方法中金屬元素的曲線點配制與常規(guī)方法一樣，定容體積為1 mL。每個曲線點做三次取平均，操作步驟同有效性驗證試驗一樣，分別測量5 min和15 min，記錄數據。調整各元素曲線點范圍，直至達到我們預期效果。

2 結果與討論

2.1 數據統(tǒng)計

汞、銅、鋅在5 min和15 min兩個反應時間內的相對發(fā)光度值及散點圖見表1～3及圖1～3。

表1 Hg元素

圖1 汞

2.2 分析討論

2.2.1 汞的毒性變化趨勢

圖1可知，汞在兩個測量時間里，相對發(fā)光度值接近，不隨時間的增加而降低。觀察曲線走勢，汞在0.02～0.15 mg/L間，相對發(fā)光度隨濃度增加而急劇減??；而在0.15～0.20 mg/L這個區(qū)間，相對發(fā)光度趨于穩(wěn)定，并不與濃度呈線性關系?？梢?，測量5 min就能夠代表汞的毒性，我們可以建立0.02～0.15 mg/L間濃度與相對發(fā)光度的曲線方程，高于0.15 mg/L，雖能反映汞的毒性，但測量不準確；說明汞濃度越高，本方法越不適用。

2.2.2 銅的毒性變化趨勢

由圖2可知，銅在兩個測量時間里，毒性變化明顯不同。測量5 min，相對發(fā)光度平滑緩慢下降，在1.5 mg/L后出現(xiàn)拐點趨于緩慢；當測量15 min，銅的毒性反應增大，相對發(fā)光度迅速下降，在1.2 mg/L之后趨于穩(wěn)定，變化不明顯。可見，15 min的測量時間才能代表銅的毒性，建立15 min范圍在0.2～1.2 mg/L內的曲線方程更有實際運用意義。

圖2 銅

2.2.3 鋅的毒性變化趨勢

由圖3可知，鋅的相對發(fā)光度與汞相似，變化小，不隨時間的增加而降低。單條曲線觀察，與銅比較，鋅曲線下降的坡度平緩?？梢娺x用5 min測量時間能夠代表其毒性大小，選擇0.2～2.0 mg/L范圍內相關性較好的點作線性回歸，高于2.0 mg/L，鋅的毒性變化不大，相對發(fā)光度達到下限，本方法不適用。

圖3 鋅

2.2.4 曲線建立與相關性檢驗

根據最小二乘法建立汞、鋅、銅的回歸方程，見表4，并做相關性檢驗。

表4 相關線性曲線

表4中曲線方程建立是否具有意義，需對相關系數R進行檢驗。查相關系數臨界值Rα表[3]，比較Rα與R絕對值的大小，只有當曲線R的絕對值≥Rα時，所配的直線才有意義。相關系數臨界值Rα表[3]中，Rα為相關系數的臨界值，它的選擇與測量次數n以及給定的顯著性水平α有關，?為自由度，?=n-2。

（注：Rα為數臨界值；n為樣本總量；α為顯著性水平；?為自由度。）

汞：在0.02～0.15 mg/L線性范圍內，表1測量7次，n=7，?=n-2=5，給定α最高等0.001，故查表[3]得Rα=0.95074，表4中RHg=0.994，大于Rα，故汞的濃度與相對發(fā)光度間高度相關。

銅：在0.20～1.2 mg/L線性范圍內，表2測量6次，n=6，?=n-2=4，給定α較高等0.01，故查表[3]得Rα=0.91720，表4中RCu=0.960，大于Rα，故銅的濃度與相對發(fā)光度間顯著相關。

表2 Cu元素

鋅：在0.20～2.0 mg/L線性范圍內，表3測量8次，n=8，?=n-2=6，給定α最高等0.001，故查表[3]得Rα=0.92493，表4中RZn=0.979，大于Rα，故鋅的濃度與相對發(fā)光度間高度相關。

表3 Zn元素

比較表4三個元素相關系數R大小，RHg最接近1，符合GB/T15441-1995《水質 急性毒性的測定 發(fā)光細菌法》[4]中以氯化汞為標準溶液的要求，鋅、銅次之。

2.2.5 低毒時濃度點值確定

中國科學院南京土壤研究所以氯化汞為參比毒物，用其相對發(fā)光度和與其相對應的氯化汞濃度表達毒物等級，將水質毒性分為5個等級[5]，見表5。

表5 水質毒性等級

根據表5定義相對發(fā)光度為70%時，毒物毒性為低毒等級，于是我們將70%代入汞曲線計算，得到汞濃度0.06 mg/L，小于0.07 mg/L，符合表5定義。同理計算銅和鋅的低毒濃度值是0.63 mg/L、0.95 mg/L，三者毒性大小關系：汞＞銅＞鋅。

3 結論與意義

3.1 汞、銅、鋅對明亮發(fā)光桿菌的急性毒性都有顯著效應，都與相對發(fā)光度成顯著負相關，毒性強度明顯不同，汞>銅>鋅。根據中國科學院南京土壤研究所對毒物等級的評價，最低毒性劑量分別在0.06 mg/L、0.63 mg/L、0.95 mg/L左右。

3.2 三種金屬對明亮發(fā)光桿菌發(fā)揮的毒性作用時間不同，汞、鋅作用5 min能夠完全代表物質的毒性大小，而銅則需要15 min更為準確，在應急監(jiān)測過程中，能為我們提供更為快速、準確的方法。

3.3 汞濃度超過0.15 mg/L，鋅濃度超過2.0 mg/L，而銅在15 min測量模式下超過1.2 mg/L時，相對發(fā)光度達到下限，測量結果不準確，本方法不適用。

3.4 建立了三個元素在此方法中相對準確的曲線方程及線性范圍，見表4。檢驗其相關性得到汞＞鋅＞銅，符合國標。