殷涵臻，張傳健，曾榮愚，費榮梅，王繼春

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；4. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；5. 天康制藥(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215000)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒1型(suid herpesvirus，SuHV-Ⅰ)，最早由匈牙利科學(xué)家所分離[1]。該病毒可引發(fā)偽狂犬病(pseudorabies，PR)，許多家畜和野生哺乳動物感染該病會出現(xiàn)神經(jīng)、呼吸和生殖系統(tǒng)等的癥狀，如瘙癢(小鼠)、繁殖障礙(母豬)、呼吸困難(成年豬)、嘔吐抽搐(仔豬)等[2]。20世紀(jì)50年代，我國豬場首次暴發(fā)PR，后使用源自匈牙利的弱毒苗Bartha-K61使該病得到了有效控制[3]。然而，2011年以來，PRV變異株在我國豬群中暴發(fā)流行，其致病力和傳播力明顯高于傳統(tǒng)毒株，傳統(tǒng)的Bartha-K61已無法提供完全保護(hù)[4-5]，新型疫苗的研制迫在眉睫。

TK、PK、gE/gI等為PRV重要的毒力因子，對病毒在哺乳動物機(jī)體中的潛伏、入侵有重要作用[6]?？蒲泄ぷ髡叱０堰@些基因作為基因工程疫苗的首選靶基因。1985年，Kit等[7]構(gòu)建了第一株P(guān)RV TK基因缺失疫苗。目前，應(yīng)用變異株研發(fā)的gE/gI、gE/TK和TK/gE/gI缺失株可提供有效的保護(hù)，但對初生PRV陰性仔豬存在嚴(yán)重的安全隱患[8]，暗示其他基因可能影響其毒力。

UL3屬于早期核蛋白，編碼237個氨基酸，大小約為34 kDa[9]。目前UL3的功能尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，UL3對單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)體外復(fù)制無顯著影響[10]，但可與UL4、ICP22等相互作用從而影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位[11]。Barbara等[9]發(fā)現(xiàn)，UL3蛋白缺失不影響PRV在兔腎細(xì)胞上增殖，但關(guān)于UL3對動物致病力的影響還未見報道。

UL46基因，編碼PRV晚期蛋白。常與UL47、UL48、UL49基因共同成簇，是病毒被膜蛋白主要成分[12]。研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1和馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)的UL46皆為非必需蛋白，缺失這類蛋白會影響病毒復(fù)制[13-14]。PRV UL46突變株(基因移碼)對小鼠的致病力無顯著影響[15]。

UL50基因，編碼240個氨基酸，具有焦磷酸酶活性。研究發(fā)現(xiàn)諸多γ皰疹病毒的UL50可進(jìn)行免疫調(diào)控，但不依賴于焦磷酸酶活性[16-17]。2017年，Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PRV和HSV-1的UL50均可誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素受體降解，從而拮抗干擾素反應(yīng)。然而，目前尚無UL50對毒力影響的報道。

本研究以PRV變異株的UL3、UL46和UL50為研究對象，運用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(bacterial artificial chromosome，BAC)構(gòu)建了PRV AH02LA變異株UL3、UL46和UL50基因失活株：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行了分析，為PRV致病機(jī)制的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、BAC與實驗動物

PRV AH02LA株由本研究室分離于安徽六安某豬場PR陽性豬[19]；含BACPRV(以PRV AH02LA株為親本毒株，mini-F替換gI和gE基因)的大腸桿菌GS1783由本研究室制備[20]；豬睪丸(swine testis，ST)細(xì)胞于本研究室保存。85只SPF級實驗小鼠購自南京市青龍山動物養(yǎng)殖場(合格證編號：20210125Abzz01000000805)。

1.2 主要試劑

LATaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max聚合酶、DL10000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker和250 bp DNA ladder購自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；DNA提取液購自Solarbio公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

引物由擎科生物科技有限公司合成，如表1所示。

表1 引物序列

1.4 重組菌株的構(gòu)建

以卡那霉素(KAN)抗性基因為模板，分別以UL3knock-KAN F/R、UL46knock-KAN F/R和UL50knock-KAN F/R為引物，PCR擴(kuò)增含各基因起始密碼子前后同源臂序列的KAN抗性基因。PCR片段回收后，導(dǎo)入含BACPRV的GS1783中進(jìn)行電轉(zhuǎn)重組(電壓：1 500 V；電阻：200 Ω；電容：25 μF)，獲得3株重組菌株：BACPRV-UL3knock-KAN、BACPRV-UL46knock-KAN和BACPRV-UL50knock-KAN。第二次重組中，2 mL 3株重組菌株感受態(tài)分別加入含2%阿拉伯糖的等量液體培養(yǎng)基，42 ℃振搖15 min，誘導(dǎo)環(huán)化重組酶表達(dá)，進(jìn)行Red重組，敲除KAN抗性基因，篩選3株陽性克隆，分別命名為：BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock。應(yīng)用引物UL3 F/R、UL46 F/R和UL50 F/R對3株BAC進(jìn)行PCR和測序鑒定。

1.5 重組病毒的獲得與鑒定

應(yīng)用DNA提取試劑盒提取PRV AH02LA病毒DNA，以gE/gI F/R為引物，PCR擴(kuò)增回收含同源臂的gE/gI序列片段。BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knockDNA通過堿裂解法提取。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將10 μL含同源臂的gE/gI序列片段分別與15 μL 3株重組BAC的DNA片段共轉(zhuǎn)染單層ST細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，在紫外光(488 nm)激發(fā)下可見未發(fā)熒光的病毒蝕斑，連續(xù)挑斑純化3代，獲得3株重組病毒，分別命名為：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock。PCR和測序鑒定gE/gI基因序列。

1.6 重組病毒遺傳穩(wěn)定性檢測

重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock分別在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代20次，提取F20代病毒基因組DNA，用UL3 F/R、UL46 F/R和UL50 F/R分別對UL3、UL46和UL50基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并通過測序鑒定各基因起始密碼子是否發(fā)生回補(bǔ)或突變。

1.7 重組病毒體外生長動力學(xué)檢測

將PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock病毒分別以0.01感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)接種ST細(xì)胞。于接種后6、12、24、36、48和72 h收集細(xì)胞和病毒混合液。經(jīng)-70 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，檢測上清病毒滴度，重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 重組病毒對小鼠致病力測定

選取85只SPF級實驗小鼠，隨機(jī)分為17組，每組5只(表2)。取PRV AH02LA(107.75TCID50/mL)、PRV-UL3knock(107.2TCID50/mL)、PRV-UL46knock(106.5TCID50/mL)和PRV-UL50knock(107.3TCID50/mL)種毒，10倍倍比稀釋，稀釋度由100～10-3。攻毒采用頸部皮下注射法，每只小鼠注射0.1 mL的病毒液，對照組注射等量DMEM培養(yǎng)液。攻毒后每日觀察記錄小鼠臨床癥狀，累計14 d，并統(tǒng)計死亡情況。Reed-Muench法計算PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock對小鼠的LD50。

表2 小鼠試驗分組

2 結(jié)果

2.1 重組菌株BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock的獲得與鑒定

通過第一步Red重組，BACPRV插入KAN抗性基因的同時刪除UL3、UL46和UL50基因起始密碼子，PCR檢測發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)菌株的UL3、UL46和UL50基因序列大小增加約1 000 bp(圖1)。然后通過第二步Red重組，敲除KAN抗性基因，分別命名為：BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock。PCR(圖1)和測序表明UL3、UL46和UL50起始密碼子已成功敲除。

M. Marker;1. UL3;2. 敲除KAN基因;3. 插入KAN基因;4. UL46;5. 敲除KAN基因;6. 插入KAN基因;7. UL50;8. 敲除KAN基因;9. 插入KAN基因

2.2 重組毒株P(guān)RV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的獲得與鑒定

BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knockDNA分別與帶有同源臂的gE/gI序列片段共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，拯救病毒的同時，gE/gI序列替換mini-F序列，在紫外光(488 nm)下可見未發(fā)熒光的病毒蝕斑，經(jīng)3輪挑斑純化，獲得重組病毒：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock(圖2)。gE/gI序列經(jīng)PCR(圖3)和測序鑒定正確。

圖2 重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的純化

M. DL15000 DNA Marker; 1. PRV AH02LA; 2. PRV-UL3knock; 3. PRV-UL46knock; 4. PRV-UL50knock

2.3 重組毒株P(guān)RV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock遺傳穩(wěn)定性測定

將重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock于ST細(xì)胞中傳代20次，提取F20代重組病毒DNA，對UL3、UL46和UL50基因進(jìn)行PCR和測序鑒定，結(jié)果表明UL3、UL46和UL50起始密碼子未有發(fā)生回補(bǔ)或突變(數(shù)據(jù)未列出)，表明遺傳穩(wěn)定性良好。

2.4 重組毒株P(guān)RV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock體外生長動力學(xué)檢測

PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock分別以0.01 MOI接種ST細(xì)胞，在指定時間點檢測上清與細(xì)胞混合物滴度，并繪制其生長曲線(圖4)。PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock在感染后12 h(PRV-UL3knock：102.6TCID50/mL； PRV-UL46knock：0；PRV-UL50knock：102.75TCID50/mL)和36 h(PRV-UL3knock：106.5TCID50/mL；PRV-UL46knock：106.38TCID50/mL；PRV-UL50knock：106.55TCID50/mL)病毒滴度明顯低于親本毒株(12 h：103.0TCID50/mL；36 h：107.5TCID50/mL)。PRV-UL46knock在感染后6 h和12 h未檢測到毒價。以上結(jié)果表明，UL3、UL46和UL50可能介導(dǎo)病毒復(fù)制。PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock滴度峰值分別為：107.5TCID50/mL、106.8TCID50/mL、106.7TCID50/mL和107.1TCID50/mL。

圖4 PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock體外生長動力學(xué)

2.5 PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock對小鼠致病力分析

根據(jù)表3統(tǒng)計，計算PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的LD50依次為：104.44TCID50、104.5TCID50和104.05TCID50，與PRV AH02LA親本毒均相似(LD50：104.91TCID50)。表明UL3、UL46和UL50對小鼠致病性無顯著影響。

表3 小鼠試驗結(jié)果

續(xù)表3

3 討論

2011年以來，PRV變異株給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失[21-22]，新型疫苗的研發(fā)是控制該病的關(guān)鍵，一些未知毒力基因的鑒定尤為重要。目前關(guān)于UL3、UL46和UL50對PRV復(fù)制和毒力的影響尚不明確。因此，本研究通過BAC以及配套的EnPassant技術(shù)敲除UL3、UL46和UL50基因起始密碼子，構(gòu)建3種基因失活株，并進(jìn)行了體外生長特性和對小鼠致病性的研究。

本研究所采取BAC及其相關(guān)的EnPassant技術(shù)是皰疹病毒研究的最先進(jìn)技術(shù)，BAC技術(shù)使得對皰疹病毒基因組進(jìn)行缺失、突變和插入的分子生物學(xué)操作可以在大腸桿菌中進(jìn)行，能大大提高研究效率，且基因不易發(fā)生變異[23]。本研究第一步重組是將包含UL3、UL46和UL50基因起始密碼子前后同源臂序列的KAN抗性基因電轉(zhuǎn)至大腸桿菌GS1783，與BACPRV進(jìn)行同源重組。第二步重組基于溫敏啟動子調(diào)控，阿拉伯糖誘導(dǎo)Cre酶表達(dá)，完成KAN抗性基因的敲除，從而構(gòu)建3種基因失活株。

體外生長性能試驗發(fā)現(xiàn)，UL3、UL46和UL50突變失活株在感染后12和36 h滴度顯著低于PRV AH02LA親本株，暗示UL3、UL46和UL50可能介導(dǎo)病毒復(fù)制。UL3編碼病毒的早期核蛋白，先前研究表明UL3缺失對PRV在兔腎細(xì)胞上的復(fù)制無顯著影響[9]，因此，關(guān)于UL3對PRV在不同細(xì)胞復(fù)制的影響及其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。PRV UL46蛋白可通過拮抗細(xì)胞Ⅰ型干擾素反應(yīng)[24]，從而促進(jìn)了病毒對細(xì)胞的入侵。此外，UL46蛋白可調(diào)節(jié)核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD)，NEBD可促進(jìn)病毒排出細(xì)胞[25-26]，從而加快對其他細(xì)胞的入侵。對HSV-1研究發(fā)現(xiàn)，UL46缺失降低HSV-1復(fù)制水平，減少蝕斑大小[27]。研究表明，PRV與HSV-1 UL50均可以通過降解干擾素受體，抑制α-干擾素反應(yīng)[14]，促進(jìn)病毒免疫逃逸。以上研究在一定程度上解釋了UL3、UL46和UL50失活株在感染12和36 h低于親本株的原因，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。此外，后續(xù)研究將應(yīng)用q-PCR對病毒含量進(jìn)行驗證，也將通過兔腎細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞對3種失活株生長動力學(xué)進(jìn)行鑒定。

小鼠作為PRV的非自然宿主，可引起極高的致死率。對小鼠致病力試驗發(fā)現(xiàn)，PRV-UL3knock、PRV-UL46knock、和PRV-UL50knock對小鼠的LD50與PRV AH02LA親本株相似，表明3種蛋白對小鼠致病性無顯著影響。為準(zhǔn)確鑒定UL3、UL46和UL50基因是否失活，之后還需通過Western blot進(jìn)行驗證。

綜上所述，本研究通過BAC以及配套的EnPassant技術(shù)構(gòu)建了UL3、UL46和UL50突變失活株。UL3、UL46和UL50突變失活株在感染12和36 h滴度顯著低于PRV AH02LA親本株，表明UL3、UL46和UL50可能介導(dǎo)病毒復(fù)制，具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外，本研究首次分析了UL3、UL46、UL50基因?qū)RV毒力的影響，為PRV致病機(jī)制的研究提供了參考。