晁哲，邢漫萍，黃麗麗，孫瑞萍，劉海隆，魏立民，劉圈煒，鄭心力

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?571100)

海南黑山羊是海南省唯一的地方山羊品種，在《中國畜禽遺傳資源志(羊志)》中，海南黑山羊被歸類為雷州山羊。海南黑山羊具有肉質(zhì)好、耐高溫高濕、耐粗飼、合群性強(qiáng)等特點(diǎn)，其作為重要的產(chǎn)肉動(dòng)物和地方品種資源，在生產(chǎn)和科研上都具有重要價(jià)值[1]。近年來，海南黑山羊的市場(chǎng)需求量逐年增加，但其供給嚴(yán)重不足，導(dǎo)致此種現(xiàn)象的原因之一就是海南黑山羊繁殖性能較差、產(chǎn)羔數(shù)少且不穩(wěn)定。因此，在常規(guī)雜交改良的同時(shí)，通過分子遺傳學(xué)方法對(duì)海南黑山羊繁殖性能進(jìn)行研究，鑒定與海南黑山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因，篩選可用的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，有助于提高海南黑山羊的繁殖效率，增加其養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。

生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15, BMP15)對(duì)哺乳動(dòng)物卵泡正常的生長(zhǎng)和分化具有重要的調(diào)節(jié)功能，被認(rèn)為是影響畜禽繁殖性能的主要候選基因[2-3]。在綿羊和山羊中，GDF9和BMP15基因作為控制產(chǎn)羔數(shù)的重要候選基因被廣泛研究，與之相關(guān)的SNP位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，并在不同品種的綿羊和山羊群體中被驗(yàn)證[4-6]。其中，GDF9基因中存在一個(gè)重要的SNP，位于該基因編碼區(qū)260 bp處的A/G突變，該突變屬于錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第87個(gè)氨基酸由組氨酸變?yōu)榫彼醄7-8]；BMP15基因同樣存在一個(gè)錯(cuò)義突變，位于該基因編碼區(qū)805 bp處的C/G突變，該突變引起第269個(gè)氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼醄9]。目前，關(guān)于海南黑山羊GDF9基因和BMP15基因與產(chǎn)羔數(shù)間的關(guān)系研究尚未見報(bào)道。本研究通過PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得海南黑山羊GDF9基因和BMP15基因序列信息，鑒定基因中的SNP位點(diǎn)，分析基因多態(tài)性與海南黑山羊初胎產(chǎn)羔數(shù)間的關(guān)系，為海南黑山羊資源保護(hù)與開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在海南澄邁福羊牧業(yè)有限公司采集70只海南黑山羊母羊耳組織樣品，在海南開泰東山羊產(chǎn)業(yè)有限公司采集86只海南黑山羊母羊耳組織樣品。耳組織樣品采集后立即放入冰盒，送回實(shí)驗(yàn)室后放置在-20 ℃冰箱，用于提取基因組DNA。在采集耳組織樣品的156只海南黑山羊母羊中，統(tǒng)計(jì)出139只母羊的初胎產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 主要試劑

2×TaqMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；D2000 DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化學(xué)試劑如無水乙醇等，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 基因組DNA的提取

使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，用滅菌后的去離子水溶解，取部分DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中提供的山羊GDF9和BMP15基因序列(基因ID依次為：100860859和100861233)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2個(gè)基因的擴(kuò)增引物，通過序列比對(duì)尋找基因中的SNP位點(diǎn)。以上引物序列信息詳見表1和表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增山羊GDF9基因所用引物序列及特征

表2 擴(kuò)增山羊BMP15基因所用引物序列及特征

1.5 PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列比對(duì)

25 μL PCR反應(yīng)體系：樣品DNA(100 ng/μL)1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)熱4 min；94 ℃變性45 s，退火45 s(每對(duì)引物的退火溫度見表1和表2)，72 ℃延伸50～80 s(由片段長(zhǎng)度決定)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)分析使用在線軟件Multiple Sequence Alignment(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)完成。

1.6 多態(tài)性檢測(cè)

使用GD1-F/GD1-R引物檢測(cè)GDF9基因+183處的A/C突變和+260處的A/G突變，G3F/G3R引物檢測(cè)GDF9基因+2 082處的A/C突變和+2 541處的C/T突變。使用B1F/B1R引物檢測(cè)BMP15基因-519處的A/G突變，BMP15-1F/BMP15-1R引物檢測(cè)BMP15基因+6 048處的A/G突變、+6 121處的C/G突變和+6 124處的C/G突變。PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件均與1.5中的描述相同。PCR產(chǎn)物測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，通過測(cè)序峰圖判定基因型，單峰表示純合子，雙峰表示雜合子。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

建立單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型，利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute Inc,Version 8 Edition)GLM程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，同時(shí)采用REG程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。模型為：Yijk=μ+Gi+Sj+Fk+eijk，模型中Yijk是性狀表型值，μ是均值，Gi是基因型效應(yīng)(包括加性效應(yīng)和顯性效應(yīng))，Sj、Fk是固定效應(yīng)，分別是胎次(初產(chǎn)是0，經(jīng)產(chǎn)是1)、場(chǎng)區(qū)效應(yīng)(海南澄邁福羊牧業(yè)有限公司是0，海南開泰東山羊產(chǎn)業(yè)有限公司是1)，eijk是殘差。

2 結(jié)果

2.1 GDF9基因PCR擴(kuò)增與序列分析

使用3對(duì)引物擴(kuò)增海南黑山羊GDF9基因，分別得到長(zhǎng)度為761、796和871 bp的DNA序列，見圖1。

M.D2000 DNA Marker;1. G1F/G1R引物擴(kuò)增片段;2. G2F/G2R引物擴(kuò)增片段;3. G3F/G3R引物擴(kuò)增片段

通過比對(duì)10頭海南黑山羊GDF9基因的3個(gè)擴(kuò)增片段序列，共發(fā)現(xiàn)3處堿基突變，見表3。這3處堿基突變分別位于GDF9基因的第1外顯子、第2外顯子和3′端。

表3 海南黑山羊GDF9基因序列比對(duì)結(jié)果

2.2 BMP15基因PCR擴(kuò)增與序列分析

使用3對(duì)引物擴(kuò)增海南黑山羊BMP15基因，分別得到長(zhǎng)度為835、859和975 bp的DNA序列，見圖2。

M.D2000 DNA Marker;1. B1F/B1R引物擴(kuò)增片段;2. B2F/B2R引物擴(kuò)增片段;3. B3F/B3R引物擴(kuò)增片段

通過比對(duì)10頭海南黑山羊BMP15基因的3個(gè)擴(kuò)增片段序列，共發(fā)現(xiàn)2處堿基突變，見表4。這2個(gè)堿基突變分別位于BMP15基因的5′端和第2外顯子。

表4 海南黑山羊BMP15基因序列比對(duì)結(jié)果

2.3 GDF9和BMP15基因多態(tài)性分析

在GDF9基因中，位于+183處的A/C突變(圖3)在海南黑山羊群體的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，A和C兩個(gè)等位基因頻率分別是0.23和0.77；位于+2 082處的A/C突變(圖4)在海南黑山羊群體的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，A和C 2個(gè)等位基因頻率分別是0.86和0.14；位于+2 541處的C/T突變(圖5)，C等位基因和T等位基因在海南黑山羊群體中的基因頻率分別是0.42和0.58(表5)。

1. AA基因型;2. AC基因型;3. CC基因型

1. AA基因型;2. AC基因型;3. CC基因型

在BMP15基因中，位于-519處的A/G突變(圖6)在海南黑山羊群體內(nèi)呈多態(tài)性分布，A等位基因和G等位基因頻率分別是0.51和0.49；位于+6 124處的C/G突變(圖7)在海南黑山羊群體內(nèi)呈偏態(tài)分布，CC基因型是優(yōu)勢(shì)基因型，C等位基因頻率達(dá)到0.96(表5)。

表5 GDF9和BMP15基因在海南黑山羊中的多態(tài)性分布

1. AA基因型;2. AG基因型;3. GG基因型

1. CC基因型;2. CG基因型

2.4 基因多態(tài)性與初胎產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)的139只海南黑山羊母羊初胎產(chǎn)羔數(shù)，使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件研究了GDF9基因+183處的A/C突變、+2 082處的A/C突變、+2 541處的C/T突變，BMP15基因-519處的A/G突變與產(chǎn)羔數(shù)間的聯(lián)系。結(jié)果顯示，只有GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)(表6)，TT基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC基因型個(gè)體(P<0.05)，且加性效應(yīng)極顯著(P<0.01)。

表6 GDF9和BMP15基因多態(tài)性與初胎產(chǎn)羔數(shù)間的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

GDF9屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的成員，該基因家族對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用[10]，在胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多種生物過程中扮演重要角色[11-12]。哺乳動(dòng)物的GDF9和GDF3在1993年被發(fā)現(xiàn)，GDF3主要在成年人的骨髓、脾臟、胸腺和脂肪組織中表達(dá)，而GDF9僅在卵巢中表達(dá)[13]。BMP15又稱生長(zhǎng)分化因子9B(growth differentiating factor 9B, GDF9B)，它也是TGF-β超家族的成員之一，與GDF9結(jié)構(gòu)同源且功能類似[14]。BMP15最早是在人、嚙齒動(dòng)物和綿羊的卵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其主要生理功能是調(diào)控動(dòng)物卵泡的發(fā)育過程，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和排卵[15]。

提高羊群產(chǎn)羔數(shù)一直都是畜牧育種工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。GDF9和BMP15作為能夠有效增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的重要候選基因，研究者首先在綿羊中進(jìn)行了廣泛的多態(tài)性檢測(cè)和性狀關(guān)聯(lián)分析。在Cambridge和Belclare綿羊群體中，Hanrahan等[7]發(fā)現(xiàn)GDF9基因序列中存在8個(gè)SNP位點(diǎn)，依次命名為G1～G8，其中G1、G4、G6、G7、G8突變引起編碼氨基酸的改變；同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMP15基因中存在4個(gè)突變位點(diǎn)，分別命令為B1～B4，其中B1屬于堿基(CTT)缺失，B2、B3和B4屬于單堿基突變。隨后，在伊朗的Moghani和Ghezel綿羊[16]、印度的Garole綿羊[17]等群體中，均檢測(cè)到GDF9和BMP15基因突變位點(diǎn)的存在。GDF9基因中的G1是指編碼區(qū)260 bp處的A/G突變位點(diǎn)，國內(nèi)飼養(yǎng)的主要綿羊品種如湖羊、小尾寒羊、杜泊羊、洼地綿羊等，在該位點(diǎn)都存在2種基因型(GG和AG)，國內(nèi)山羊地方品種如貴州白山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊，在該位點(diǎn)以GG基因型為主，伴有少量的AG基因型，內(nèi)蒙古絨山羊則只檢測(cè)到GG基因型[18]。本試驗(yàn)群體中只有GG基因型，說明在海南黑山羊中可能不存在G1突變位點(diǎn)。同樣，在BMP15基因中已報(bào)道的+6 048處的A/G突變和+6 121處的C/G突變?cè)诤Ｄ虾谏窖蛉后w中也不存在。本研究在海南黑山羊GDF9和BMP15基因中共發(fā)現(xiàn)5處堿基突變，基因多態(tài)性位點(diǎn)少于其它綿羊和山羊品種，主要原因是海南黑山羊長(zhǎng)期飼養(yǎng)在海南島，環(huán)境相對(duì)封閉，造成基因純和度較高。此外，5處堿基突變中有2處是首次發(fā)現(xiàn)，分別是GDF9基因中+2 541處的C/T突變和BMP15基因中-519處的A/G突變，這說明海南黑山羊具有獨(dú)特的種質(zhì)特性。

除了通過單基因標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)GDF9和BMP15基因?qū)d羊產(chǎn)羔數(shù)有影響外[19-20]，借助全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，研究者在法國Grivette綿羊和波蘭Olkuska綿羊群體中檢測(cè)到BMP15基因與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)[21]，在挪威白色綿羊群體中發(fā)現(xiàn)GDF9基因與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)[22]。山羊和綿羊?qū)儆谕频煌瑢俚膭?dòng)物，雖然有很多相似之處，但在生物學(xué)和生理學(xué)上差異較大，例如山羊有30對(duì)染色體，而綿羊只有27對(duì)染色體。對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)有影響的GDF9和BMP15基因，在山羊不同品種中是否有效，研究者做了大量的驗(yàn)證工作。在濟(jì)寧青山羊中，我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)GDF9基因中有4個(gè)SNP位點(diǎn)，分別位于第1內(nèi)含子和第2外顯子中，其中第2外顯子中的1個(gè)A/C突變位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)，該位點(diǎn)CC基因型和AC基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA基因型個(gè)體[23]。但與此相反，伊朗的研究者在Markhoz山羊中，也發(fā)現(xiàn)GDF9基因中存在4個(gè)SNP位點(diǎn)，但這4個(gè)位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)都沒有顯著性影響[24]。BMP15基因不同基因型在貴州黑山羊群體中對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，但在酉州烏羊、印度本地黑山羊中則表現(xiàn)為差異不顯著[25-26]。由此可見，在不同山羊品種中，因遺傳背景的差異導(dǎo)致GDF9和BMP15基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)間的連鎖關(guān)系不同。在海南黑山羊群體中，GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產(chǎn)羔數(shù)有緊密的連鎖關(guān)系，我們將繼續(xù)收集海南黑山羊不同胎次的產(chǎn)羔數(shù)，針對(duì)該突變位點(diǎn)進(jìn)一步研究GDF9基因多態(tài)性對(duì)海南黑山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響。

目前，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，在云南黑山羊群體中已鑒定出2個(gè)影響產(chǎn)羔性狀的重要候選基因，分別是溶質(zhì)載體家族4成員10(solute carrier family 4 member 10, SLC4A10)和T-box轉(zhuǎn)錄因子(T-box brain transcription factor, TBR1)[27]。海南黑山羊和云南黑山羊同屬中國南方山羊品種，下一步我們將在海南黑山羊群體中驗(yàn)證SLC4A10和TBR1對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響，期待發(fā)現(xiàn)更多的有助于提高海南黑山羊產(chǎn)羔數(shù)的基因標(biāo)記。

4 結(jié)論

在海南黑山羊群體中，GDF9基因存在3處堿基突變，分別位于GDF9基因的第1外顯子、第2外顯子和3′端，BMP15基因存在2處堿基突變，分別位于BMP15基因的5′端和第2外顯子；GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)，TT基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CC基因型個(gè)體。該研究結(jié)果為海南黑山羊繁殖性狀的選育提供可用的分子標(biāo)記。