高俊濤，馮憲敏，萬 朋，駱曉峰，朱文赫，徐俊杰，田洪艷，呂士杰

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

微波輻射對機體功能產(chǎn)生危害[1-3]，特別是導(dǎo)致雄性精子發(fā)育及生殖功能異常[4]，目前對微波輻射引起的雄性生殖功能損傷尚缺乏特效的防治方法，蛹蟲草多糖具有減輕雙酚A導(dǎo)致的生殖功能損傷作用[5]。本試驗分別從小鼠性行為能力和氧化應(yīng)激水平等方面來研究蛹蟲草多糖減輕微波輻射致小鼠生殖功能損傷作用，為研究微波輻射對生殖系統(tǒng)的影響及防治措施提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 輻射儀(大功率微波雷達發(fā)射機改裝而成的微波發(fā)射機)；Hitachi 7600生化分析儀；BA300型數(shù)碼生物顯微鏡；酶標儀；MuseTM細胞分析儀。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，睪酮(Testosterone，TTE)酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒，均購自南京建成生物技術(shù)研究所(批號依次為：20180610、20180613、20480611和20180620)。蛹蟲草多糖的制備：稱取5 g蛹蟲草的基質(zhì)粉末，加入200 mL水，搖勻，再加入2 000 U的纖維素酶2.5 mL，調(diào)節(jié)pH到4.8，50 ℃水浴1.5 h，再轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴中滅酶處理2 h，然后再進行超聲波處理，30 ℃處理40 min，4 200 r/min離心10 min，收集上清糖液。將收集到的糖液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定體積，采用Sevag法除蛋白，除蛋白后的糖液采用4 倍體積的95%乙醇進行醇沉，在4 ℃冰箱中醇沉24 h，經(jīng)抽濾、冷凍干燥得到蛹蟲草多糖(Cordyceps militaris polysaccharide，CMP)。

1.2 試驗分組與處理 選擇清潔級昆明小鼠75只，雄性，體重(18±2)g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(吉)2016—0002。實驗動物隨機分為5組，即對照組、模型組、蛹蟲草多糖低、中、高劑量組，每組15只。模型組和各蛹蟲草多糖組進行10 mW/cm2微波照射，時間60 min，1次/d，共30 d。將對照組小鼠每天在同一時間放置于微波輻射源喇叭口正上方60 min，但不進行微波照射，共30 d。最后1次照射后6 h進行小鼠性行為能力測試。各蛹蟲草多糖組于最后1次照射后12 h，以低[10 mg/(10 g·bw)]、中[20 mg/(10 g·bw)]、高[40 mg/(10 g·bw)]劑量蛹蟲草多糖提取物，按0.3 mL/(10 g·bw)灌胃，1次/d,連續(xù)灌胃30 d，模型組和對照組小鼠給予等體積生理鹽水，最后1次灌胃后6 h進行小鼠性行為能力測試，12 h后取材。

1.3 性行為能力的觀察 參照Anders[6]方法進行，雄性小鼠的第1次撲捉時間即撲捉潛伏期(CIP)，同時觀察雄性小鼠在30 min內(nèi)對雌性小鼠的撲捉次數(shù)(CT)。

1.4 精子相對計數(shù)測定 小鼠處死，雄性小鼠冰浴下取睪丸、附睪。睪丸稱重，計算睪丸指數(shù)，附睪37 ℃ 孵育、游離精子、過濾得精液，涂片經(jīng)固定、染色后在顯微鏡下計數(shù)精子數(shù)。

1.5 精子畸形率測定 附睪組織懸液涂片，干燥12 h，伊紅染色，高倍鏡下觀察精子畸形。每組隨機視野計數(shù)1 000個精子，記錄畸形精子數(shù)量，計算精子畸形率。

1.6 精子存活率測定 收集細胞使用MuseTM細胞分析儀檢測精子死亡率，計算精子存活率。

1.7 血清SOD、GSH-Px、MDA和TTE檢測 小鼠眼球摘除取血，離心，分離血清備用待測。依照試劑盒說明書要求測定血清中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量，ELISA法檢測小鼠血清中TTE含量。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草多糖對微波輻射雄性小鼠性行為的影響 與對照組比較，微波輻射30 d后小鼠的CIP顯著延長、CT顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，蛹蟲草多糖中劑量組(P<0.05)、蛹蟲草多糖高劑量組(P<0.01)的CIP顯著縮短，CT顯著增加(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠CIP、CT比較

2.2 蛹蟲草多糖對微波輻射雄性小鼠精子的影響 與對照組比較，微波輻射30 d后小鼠的精子相對計數(shù)明顯減少(P<0.05)，精子畸形率明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，蛹蟲草多糖中劑量組(P<0.05)、蛹蟲草多糖高劑量組(P<0.01)精子相對計數(shù)顯著增加，精子畸形率顯著減少(P<0.05)(表2)。各組小鼠精子形態(tài)見圖1。

表2 各組小鼠精子相對計數(shù)、畸形率、精子存活率比較

圖1 小鼠精子形態(tài)(400×)

2.3 蛹蟲草多糖對微波輻射雄性小鼠血清中SOD和GSH-Px活性、MDA和TTE含量的影響 與對照組比較，微波輻射小鼠的SOD、GSH-Px的活性、TTE水平顯著降低(P<0.05)，MDA的含量顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，蛹蟲草多糖中、高劑量組SOD、GSH-Px的活性、TTE水平顯著增加(P<0.05)，MDA的含量顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組小鼠血清SOD和GSH-Px活性、MDA和TTE含量比較

3 討論

蛹蟲草多糖是蛹蟲草中含量最多的藥理活性物質(zhì)，是一類高分子復(fù)合物，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、降血糖[9]、降血脂[10]、提高免疫力[11]等作用，而蛹蟲草多糖對微波輻射所致的雄性生殖系統(tǒng)損傷的研究少有報道。微波輻射導(dǎo)致機體缺血缺氧并產(chǎn)生過量的氧化自由基，最終導(dǎo)致多器官功能障礙[12-13]。微波輻射對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良的影響，易出現(xiàn)過熱而造成睪丸損傷。本試驗表明，持續(xù)微波輻射環(huán)境可引起精子活動力下降，畸形率增加，存活率降低等。研究表明，微波輻射能夠引起代謝改變，從而影響雄性生殖系統(tǒng)。微波輻射過程中睪丸和生精細胞產(chǎn)生的過氧化物與精子的生理功能有關(guān)[14-15]。過氧化傷害引起精子膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致雄性不育。MDA是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，可反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生的程度。SOD、GSH-Px反映機體的抗氧化能力。本試驗結(jié)果表明，微波輻射可以導(dǎo)致精子的相對數(shù)量減少而精子的畸形率增加，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px的活性、TTE水平均較對照組降低而MDA含量顯著升高，蛹蟲草多糖能夠提高精子的相對數(shù)量、精子存活率、血清SOD和GSH-Px的活性、TTE水平，降低精子的畸形率、MDA含量，上述結(jié)果提示，蛹蟲草多糖能改善微波輻射對雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響，其作用機制可能與減輕生殖細胞的氧化損傷有關(guān)。