陳 雪，王 鶯，康 晶，賴增妍，鄭連文 , 趙東海

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041)

因生活習(xí)慣改變，如久坐、缺乏運(yùn)動(dòng)等，會(huì)使男性睪丸處于高溫環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷發(fā)生。有報(bào)道稱，小鼠在熱應(yīng)激損傷后，不僅睪丸組織受到損害，而且精子質(zhì)量也會(huì)發(fā)生異常，導(dǎo)致生殖功能低下[1]。

毛蕊花糖苷是中藥肉蓯蓉的有效成分[2]。有研究表明，毛蕊花糖苷可改善小鼠睪丸萎縮和雄激素減少，減少勃起潛伏期和增加精子數(shù)量[3]。目前，有關(guān)毛蕊花糖苷在雄性生殖功能改善的研究尚不深入，相關(guān)的作用機(jī)理仍不清晰。本試驗(yàn)通過制備熱應(yīng)激損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3)模型，觀察毛蕊花糖苷對(duì)TM3熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，從而為毛蕊花糖苷在雄性生殖損傷保護(hù)中的開發(fā)和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 F12培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素，美國(guó)Sigma 公司；總蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Cleaved-caspase 3多克隆抗體,美國(guó)Cell Signal公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物公司。

1.2 主要儀器 倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯)；高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Ependoff公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀、垂直電泳槽(美國(guó)BioRad 公司)；CO2培養(yǎng)箱、旋渦震蕩儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 試驗(yàn)對(duì)象 細(xì)胞株TM3，購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) TM3用含1%雙抗、10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃ 培養(yǎng)箱中。定期換液，并根據(jù)生長(zhǎng)情況傳代。試驗(yàn)分為6組：正常對(duì)照組、熱損傷模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以及參考文獻(xiàn)[4]方法，TM3置于5% CO2、飽和濕度、40 ℃培養(yǎng)箱中制備熱應(yīng)激損傷TM3細(xì)胞模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TM3消化后，以1×105個(gè)/mL的濃度接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，熱損傷模型組、毛蕊花糖苷組和陽性對(duì)照組TM3移至5% CO2、40 ℃培養(yǎng)箱。其中，毛蕊花糖苷低、中、高劑量組分別加入終濃度為25、50 μg/mL和100 μg/mL的毛蕊花糖苷。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，陽性對(duì)照組加入終濃度為50 IU/mL的維生素C，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4.2 MTT法測(cè)定各組TM3存活率 各試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)4 h后,加入終濃度0.5 μg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值(A)。假設(shè)正常對(duì)照組細(xì)胞全部存活，計(jì)算其余各組存活率。細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

1.4.3 Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，洗滌離心后加入100 μL 1×Binding buffer重懸。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液混勻，避光室溫反應(yīng)10～15 min。加400 μL 1×Binding buffer，混勻置于冰上，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用Cell Quest軟件進(jìn)行分析，以FITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。

1.4.4 Western Blot法測(cè)定TM3凋亡相關(guān)蛋白基因Caspase-3、Bax與Bcl-2的表達(dá) 收集各組TM3，用預(yù)冷的PBS清洗，加入RIPA裂解液，超聲3%功率，冰上裂解5 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用溴酚藍(lán)和裂解液將蛋白調(diào)整成等濃度后，煮沸10 min，變性后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)2 h到PVDF膜上，TBST配制的5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后將PVDF膜與經(jīng)TBST稀釋的一抗(Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min后加入1∶5 000 的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，進(jìn)行拍照及灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊花糖苷與熱應(yīng)激損傷TM3存活率 與正常對(duì)照組比較，熱損傷模型組部分細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)。不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，與模型組相比，低劑量組細(xì)胞存活率升高(P<0.05);中、高劑量組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)，且呈濃度依賴性。毛蕊花糖苷高劑量組細(xì)胞存活率與陽性對(duì)照組相近(P>0.05)。見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷對(duì)熱應(yīng)激損傷TM3存活率的影響

2.2 毛蕊花糖苷與熱應(yīng)激損傷TM3凋亡率 正常對(duì)照組、模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組的總凋亡率分別為(8.27±0.35)%、(30.33±0.81)%、(24.31±1.02)%、(18.23±0.64)%、(11.26±0.17)%和(10.43±0.53)%。本試驗(yàn)中熱損傷4 h后，模型組TM3凋亡率與正常對(duì)照組比較明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，低劑量組TM3凋亡率降低(P<0.05)；中劑量組和高劑量組TM3凋亡率明顯降低(P<0.01)，且呈濃度依賴性；陽性藥物組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組(P<0.01)。見圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對(duì)熱應(yīng)激損傷TM3凋亡的影響

2.3 毛蕊花糖苷與熱應(yīng)激損傷TM3的Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 如圖3和圖4所示，與正常對(duì)照組比較，熱損傷模型組TM3的Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.01)。與熱損傷模型組相比，不同劑量毛蕊花糖苷作用4 h后，低劑量組TM3 Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)；中劑量組和高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.01)，蛋白表達(dá)水平變化呈濃度依賴性。陽性藥物組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.01)。

圖3 毛蕊花糖苷對(duì)熱應(yīng)激損傷TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

圖4 毛蕊花糖苷對(duì)熱應(yīng)激損傷TM3 Cleaved-caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

3 討論

研究表明，睪丸長(zhǎng)期處于高溫狀態(tài)的男性可出現(xiàn)生育力下降，主要表現(xiàn)為精子質(zhì)量異常及不成熟精子比例增高[6-8]。目前，有多種途徑促使小鼠睪丸受到熱應(yīng)激，如讓小鼠睪丸置于高溫水中、利用手術(shù)制造隱睪癥和高溫狀態(tài)下飼養(yǎng)小鼠等，同時(shí)這些研究也證實(shí)睪丸受到熱應(yīng)激后會(huì)導(dǎo)致生育力下降[9-11]。毛蕊花糖苷是黃酮類的苯丙素糖苷單體，分子式為C29H36O15,分子量624.59，廣泛存在于中草藥植物中，在列當(dāng)科植物肉蓯蓉的肉質(zhì)莖中含量較高。研究表明，毛蕊花糖苷具有多種藥理活性，具有抗氧化[12]、肝保護(hù)[13]、抗炎和鎮(zhèn)痛活性等[14]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)毛蕊花糖苷處理后，可使熱損傷TM3存活率升高，凋亡率降低，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中重要的調(diào)節(jié)方式，是由基因調(diào)控的主動(dòng)死亡，可清除衰老、破損及具有潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞[15]。生精細(xì)胞的凋亡可以維持精子發(fā)生的動(dòng)態(tài)平衡，保證成熟精子的數(shù)量和質(zhì)量。有報(bào)道稱，在男性不育的致病因素中，凋亡可能起著重要的作用[16-17],可能引起特發(fā)性少精、弱精、畸形精子癥等[18-19]。一些學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，男性不育及精子異常都與一些自發(fā)或化學(xué)因素誘發(fā)的凋亡過程密切相關(guān)[20-21]。

細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要分為細(xì)胞表面死亡受體途徑及線粒體凋亡通路[22-23]。Bcl-2家族蛋白是調(diào)控線粒體凋亡通路的關(guān)鍵因子[24]。其中，Bcl-2 是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白,而Bax 是凋亡蛋白,二者可通過改變線粒體形態(tài)及外膜的通透性，影響膜間隙蛋白釋放及Caspase級(jí)聯(lián)活化調(diào)控細(xì)胞的凋亡[25]。細(xì)胞受到損傷刺激后，Bax 蛋白大量表達(dá),導(dǎo)致線粒體膜通透性加強(qiáng)，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase 3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激發(fā)細(xì)胞凋亡[26]。

熱損傷可以導(dǎo)致位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Bax 累積，當(dāng)線粒體膜上的Bcl磷酸化失活后，逐漸累積的Bax會(huì)使線粒體釋放出大量的細(xì)胞色素C，導(dǎo)致以Caspase 3為代表的凋亡蛋白家族的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷應(yīng)用于熱損傷TM3后，Bcl-2活性明顯增高，Cleaved-caspase 3、Bax活性明顯降低，Bax/Bcl-2比值降低，且呈濃度依賴性。表明毛蕊花糖苷可能通過抑制Caspase 3、Bax/Bcl-2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用。

綜上所述，毛蕊花糖苷能夠促進(jìn)熱損傷TM3增殖，降低熱損傷TM3凋亡發(fā)生，其作用機(jī)制可能與毛蕊花糖苷通過調(diào)控Caspase 3、Bax/Bcl-2蛋白信號(hào)通路抑制凋亡的發(fā)生有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果為男性不育的藥物治療提供了新思路,為研究毛蕊花糖苷的生精作用提供了科學(xué)依據(jù)。