董仙蘭，翟國蓮，徐 聰，杜娟娟，普麗花，王開勝

(1.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.云南省永德縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 臨滄 677600；3.玉溪市動物疫病預防控制中心，云南 玉溪 653100；4.玉林師范學院生物與制藥學院，廣西 玉林 537000)

近些年來，云南省雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較快，在肉雞和蛋雞養(yǎng)殖基地方面，其規(guī)模僅次于四川省，是地方特色品種最多的省份之一[1]。隨著各地養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，雞的經(jīng)濟價值就成為研究人員和養(yǎng)殖業(yè)者關注的熱點問題之一。然而，寄生蟲病成為制約雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大障礙，其中，雞住白細胞蟲病的危害較為嚴重，其原因是雞舍周圍存在庫蠓和蚋等傳播媒介，從而導致住白細胞蟲病的流行。

住白細胞蟲是瘧原蟲科(Plasmodiidae)住白細胞蟲屬(Leucoytozoon)的原蟲，主要寄生于禽類的血細胞和內(nèi)臟器官組織細胞內(nèi)，造成機體全身性出血，雞冠和肉髯蒼白[2]。在我國雞群中流行的住白細胞蟲包括卡氏住白細胞蟲(Leucocytozooncaulleryi)和沙氏住白細胞蟲(Leucocytozoonsabrazesi)兩種，其中卡氏住白細胞蟲的發(fā)病率較高，該蟲的傳播媒介為庫蠓等吸血昆蟲，具有明顯的季節(jié)性流行特點。而在其他國家，還流行史氏住白細胞蟲(Leucocytozoonsmithi)、休氏住白細胞蟲(Leucocytozoonschoutedeni)和西氏住白細胞蟲(Leucocytozoonsimondi)等[3-5]。

本試驗基于血液原蟲的線粒體細胞色素b基因(cytb)進行巢式PCR擴增，對來自云南省5個不同地理區(qū)域的部分養(yǎng)雞場進行住白細胞蟲的檢測，以期明確云南地區(qū)雞場中主要流行的住白細胞蟲蟲種類型，為有效防控云南養(yǎng)雞場住白細胞蟲病的流行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2018年7—9月，用EDTA-2K抗凝管采集云南紅河州、怒江、昭通、楚雄和臨滄5個地區(qū)的雞的血樣共計970份，樣品編號分別為紅河(HH1～HH231)、怒江(NJ1～NJ107)、昭通(ZT1～ZT136)、臨滄(LC1～LC287)和楚雄(CX1～CX209)，并記錄采樣的時間、地點、品種、性別、日齡等信息，低溫保存。帶回實驗室后置于4 ℃冰箱保存，備檢。

1.2 主要試劑和設備 1×TAE 緩沖液、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；DL2 000 DNA marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 形態(tài)學觀察 涂好的血涂片風干，利用吉姆薩染液快速染色后在顯微鏡下對住白細胞蟲進行形態(tài)學觀察。

1.4 DNA的提取與PCR擴增 按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書將采集的雞血液樣品進行DNA提取，然后將其放入-20 ℃冰箱進行保存，后續(xù)進行PCR分析。參考Iezhova等[6]報道的引物對血液原蟲cytb基因進行巢式PCR擴增。第1輪擴增引物：HAEMNF 5′-CATATATTAAGAGA-ATTATGGAG-3′；HAEMNR2 5′-AGAGGTGTAGCAT-ATCTATCTAC-3′。第2輪擴增引物：HAEMF 5′-ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3′；HAEMR2 5′-GC-ATTATCTGGATGTGATAATGGT-3′。PCR反應擴增體系為25 μL：ddH2O 11.0 μL；2×TaqPCR Master Mix 11.0 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA為2.0 μL。第1、2輪反應擴增體系一致。反應程序:第1輪94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共25個循環(huán)；72 ℃ 10 min,16 ℃結束，保存。第2輪 35個循環(huán)，其余程序均與第1輪相同。反應結束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5cytb基因部分序列測定及遺傳進化分析 將PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果用SeqMan 5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中BLAST在線比對，下載GenBank中公布的住白細胞蟲相關序列，采用鄰接法(Neighbor-joining method)在MEGA 6.0軟件中構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 統(tǒng)計與分析 將所得試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20軟件進行卡方檢驗，用SAS 9.1計算比值比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)，分析雞住白細胞蟲感染與不同地區(qū)、性別、日齡和品種之間的關聯(lián)程度。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察 住白細胞原蟲的形態(tài)特征與其在宿主體內(nèi)的發(fā)育過程密切相關，其游離裂殖子大小在0.5～1 μm，大多數(shù)情況下，在血細胞中呈單個散在，或3～7個聚集成團的狀態(tài)。進入宿主細胞中的裂殖子的位置處于紅、白細胞的胞質(zhì)中，但進入宿主細胞的裂殖子不僅僅只有1個，在某些特定情況下，會出現(xiàn)多個入侵同一細胞的情況，見圖1。

圖1 雞住白細胞蟲形態(tài)

2.2 分子鑒定 檢測結果表明，970份雞血液樣品中有34份感染住白細胞蟲，感染率為3.51%。圖2為部分雞血液樣品中住白細胞蟲的cytb基因序列PCR擴增電泳結果。將各個地區(qū)擴增的巢式PCR產(chǎn)物送至測序公司進行測序，將拼接結果在NCBI的BLAST上比對分析，樣本的序列比較見表1，本試驗樣品與泰國、印度、日本、韓國、馬來西亞的卡氏住白細胞蟲(L.caulleryi)同源性分別為99.80%、99.40%、99.79%和100.00%。

表1 部分樣品cytb基因在NCBI中BLAST同源性比較

圖2 部分樣品住白細胞蟲的cytb序列PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 雞住白細胞蟲流行分析 對云南省5個不同地理區(qū)域采集的970份雞血液樣品進行檢測，分別針對檢出住白細胞蟲的不同地理區(qū)域、性別、日齡和品種的雞進行了OR值、P值的計算，統(tǒng)計結果見表2，地理區(qū)域的陽性率從高到低是怒江、昭通、臨滄、紅河，楚雄地區(qū)未發(fā)現(xiàn)住白細胞蟲感染；性別中母雞的住白細胞蟲陽性率為高于公雞；日齡中最高的是180日齡以上，其次是90～180日齡，90日齡以下未發(fā)現(xiàn)住白細胞蟲的感染；品種中陽性率從高到低依次是毒龍原雞、草雞、白殼蛋雞、三黃雞，但羅曼蛋雞、鐵腳麻雞和黃連雞均未發(fā)現(xiàn)住白細胞蟲感染。

表2 不同地理區(qū)域、性別、日齡和品種雞住白細胞蟲的感染情況

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建 將本試驗中從紅河(HH5)、怒江(NJ2、NJ42、NJ47、NJ57)、昭通(ZT41、ZT47、ZT66)、臨滄(LC34、LC57、LC58)4個地理區(qū)域所獲得的蟲株cytb基因序列與GenBank中公布的其他住白細胞蟲相關序列進行同源性比對分析后，用MEGA 6.0軟件的N-J法構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：根據(jù)cytb基因進化樹，可大概分為兩大支，本試驗中NJ47、ZT41、ZT47、LC57所檢測到的卡氏住白細胞蟲與韓國、日本、印度等國家的雞中檢測到的卡氏住白細胞蟲以65%的置信度聚為同一大分支，并與HH5以100%的置信度聚為一支；LC34、LC58、NJ57、NJ2以100%的置信度與馬來西亞的卡氏住白細胞蟲單獨聚為另一大分支，由此可見，本次在云南地區(qū)所檢住白細胞蟲蟲株與卡氏住白細胞蟲進化支關系最為接近(圖3)。

圖3 基于住白細胞蟲cytb序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論

3.1 住白細胞蟲流行情況 卡氏住白細胞蟲病最初于1909年在越南北部發(fā)現(xiàn)，隨后印度、馬來西亞、泰國和越南等地相繼報道該病的發(fā)生[7]；1958年，日本也報道該病，同年，我國臺灣發(fā)現(xiàn)該??；1980年，張澤紀等首次在廣州地區(qū)的病雞中分離出該病原，證實我國大陸也存在卡氏住白細胞蟲的流行[8-9]。隨后，在北京、上海、廣東、廣西、陜西、山西、云南、河北、四川、福建等20多個省市報道了該病的存在與流行[10]。2003年，李國清等[11]運用PCR技術擴增了卡氏住白細胞蟲rDNA的ITS-2及部分5.8S和28S序列(ITS2+),并對該序列進行了克隆和測序。Zhao等[12]運用PCR擴增血液原蟲的cytb基因和細胞色素C氧化酶Ⅲ(coxⅢ)來檢測家禽住白細胞蟲感染情況。

本試驗用PCR擴增住白細胞蟲的cytb基因，結果顯示，云南地區(qū)部分養(yǎng)雞場存在住白細胞蟲感染，感染率為3.51%，與劉毅等[13]報道的湖南地區(qū)住白細胞蟲感染率(7.9%)，李國清等[14]報道的廣東(10.3%)、山東(12.6%)、福建(24.5%)的感染率，鐘友蘇等[15]報道的貴州道真縣沙氏住白細胞蟲的感染率(55.14%)，國外Sehgal等[16]報道的烏干達和喀麥隆的休氏住白細胞蟲感染率(18.3%)相比，本試驗中雞住白細胞蟲的感染率較低，其原因可能與各個地區(qū)的氣候條件、庫蠓和蚋等中間宿主的流行情況和飼養(yǎng)管理存在差異有關，從而導致各地區(qū)該病的感染率有所不同。本次調(diào)查的云南省5個地區(qū)的住白細胞蟲平均感染率較低，表明該蟲在云南地區(qū)的總體流行情況較輕，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這可能同大多數(shù)養(yǎng)殖場的選址較為規(guī)范、飼養(yǎng)管理水平較高有關。

3.2 感染情況分析 本試驗中，云南省怒江地區(qū)的陽性率最高，為16.82%(18/107)，紅河地區(qū)檢出的陽性率最低，為0.87%(2/231)，造成各地理區(qū)域間差異的原因可能與海拔有關。由于怒江地區(qū)的海拔略高，氣候溫暖潮濕，更有利于傳播媒介庫蠓的生長和繁殖；母雞的陽性率與公雞的陽性率相近，為4.06%(22/542)，公雞的陽性率為2.80%(36/428)，公雞和母雞均易感染住白細胞蟲，不同性別間雞住白細胞蟲的感染率無顯著性差異(P>0.05)，這與劉毅等[13]報道的湖南地區(qū)和鐘友蘇等[15]報道的貴州道真縣不同性別間雞的住白細胞蟲感染差異不顯著情況相一致；180日齡以上的雞的陽性率最高，為7.19%(33/459)，90日齡以下的雞的陽性率為0。結合樣本信息，日齡較大的雞的樣品多來源于高海拔地區(qū)，而低于90日齡的雞多來源于低海拔地區(qū)。分析其可能原因，除日齡過大的雞其抵抗力更低之外，海拔因素仍然是雞群易感該病的關鍵因素，處于高海拔地區(qū)的雞群更易感染該病。1964年，陳天鐸等[17]調(diào)查了福州地區(qū)家禽的住白細胞蟲感染情況，結果顯示，雛雞的感染率為23.07%，成年雞的感染率為52.94%；2002年，黃占欣[18]調(diào)查了河北省雞的住白細胞蟲感染情況，發(fā)現(xiàn)雛雞的感染率為27.6%，育成雞的感染率為65.2%，成年雞的感染率為49.5%，而本試驗的結果顯示，雛雞(<90日齡)的住白細胞蟲感染率為0，育成雞(90～180日齡)的感染率為2.84%，成年雞(>180日齡)的感染率為15.71%，本試驗結果同李渤南等[19]報道的雞的年齡與住白細胞蟲的感染率成正比、與發(fā)病率成反比的結果相一致；本試驗所涉及的雞的品種中，獨龍原雞的陽性率最高，為16.82%(18/107),其樣品采集均來源于怒江地區(qū)。該地區(qū)的雞多為籠養(yǎng)，其運動范圍狹窄，導致雞群間易發(fā)生交叉感染。2017年，熊維平[20]報道福建省大田縣不同品種雞住白細胞蟲感染率，其中麻雞為24.7%，三黃雞為15.0%，羅曼褐殼蛋雞為12.5%，土雜雞為15.0%；劉毅等[13]報道了湖南地區(qū)不同品種雞住白細胞蟲感染率，其中，當?shù)仉u感染率為77.1%，長沙黃雞感染率為94.6%。上述報道中，不同品種間住白細胞蟲的感染情況有所差異。本試驗中，不同品種的雞住白細胞蟲感染率也存在極顯著性差異(P<0.01)，其中的原因，一方面可能與各個地州的地理位置、氣候條件和養(yǎng)殖管理等差異有關，另一方面可能與雞本身的抵抗力有關；在對云南省部分地區(qū)的雞感染住白細胞蟲的風險因素分析中發(fā)現(xiàn)，地理環(huán)境、日齡、品種間的陽性率均存在極顯著相關性(P<0.001)，而性別間無顯著相關性(P>0.05)，因此可認為，地理環(huán)境、日齡、品種可作為影響雞感染住白細胞蟲的風險因素，而其中起主要作用的關鍵風險因素是地理環(huán)境因素。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析 進化樹分析結果表明，本試驗中的住白細胞蟲可大致分為兩大支，其中NJ47、ZT41、ZT47、LC57所檢測到的卡氏住白細胞蟲與韓國、日本、印度等國家中家禽身上檢測到的卡氏住白細胞蟲以65%的置信度聚為同一大分支，并與HH5以100%的置信度聚為一支；LC34、LC58、NJ57、NJ2以100%的置信度與馬來西亞的卡氏住白細胞蟲單獨聚為另一大分支。結果顯示，云南地區(qū)的雞中所檢出的住白細胞蟲與卡氏住白細胞蟲進化支親緣關系最為接近，且與亞洲地域流行蟲株相近。但由于本次調(diào)查中，采集并檢測到感染住白細胞蟲的樣本數(shù)量較少，因此，不排除還存在其他親緣相近的蟲種進化支的可能。

4 防治

本病目前雖有學者Ito等[23]研發(fā)了表達重組R7抗原的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉的口服疫苗，但耐藥性的問題需進一步研究，因此，目前沒有商品化的疫苗用于防控，對該病的防控只能通過阻斷傳播途徑即消滅傳播媒介(庫蠓和蚋)和提高養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理水平來降低發(fā)病率[24]。對該病有較好的治療效果的藥物是磺胺類藥物(如磺胺二甲氧嘧啶、磺胺氯丙嗪鈉、磺胺喹噁啉等都是防治本病的首選)[25]。