賀名葉，謝 旖，田世成，張卓?jī)|，劉 偉

(1.湖南省益陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413055；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

馬副蛔蟲(Parascarisequorum,P.equorum)和Parascarisunivalens是已知寄生于馬腸道內(nèi)最大的線蟲，其感染均可導(dǎo)致宿主生長(zhǎng)緩慢、腹瀉、貧血等，嚴(yán)重時(shí)宿主因腸梗塞而死亡[1]。長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者根據(jù)馬副蛔蟲和Parascarisunivalens的形態(tài)學(xué)特征、基因組特征和生理生化等特點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行比較，得到的結(jié)果存在較大差異，導(dǎo)致這兩種線蟲是否為同一個(gè)種存在較大的爭(zhēng)議[2-5]，如Nielsen等[4]調(diào)查結(jié)果認(rèn)為兩者為不同種，因?yàn)槠淙旧w數(shù)目存在差異；而Gao等[3]以線粒體全基因序列分析馬副蛔蟲與P.univalens之間同源性，發(fā)現(xiàn)兩者線粒體全基因組核苷酸序列同源性達(dá)99.1%～99.9%，提示馬副蛔蟲與P.univalens為異名同種。

對(duì)寄生蟲進(jìn)行治療或進(jìn)一步研究的前提是對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但馬屬動(dòng)物可感染兩種大型蛔蟲，分別為馬副蛔蟲和Parascarisunivalens，兩者之間形態(tài)學(xué)特征差異小，導(dǎo)致傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定手段有一定的局限性。線粒體DNA具有進(jìn)化速度快和母系遺傳等特征，利用線粒體DNA(或部分基因序列)作為分子標(biāo)記應(yīng)用于馬屬蛔蟲的分類鑒定和遺傳進(jìn)化等研究十分常見[3-5]。本試驗(yàn)采用PCR對(duì)斑馬糞便中獲得的9株蛔蟲樣品的線粒體細(xì)胞色素基因部分序列I(pcox1)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶第5亞基基因部分序列(pnad5)進(jìn)行擴(kuò)增，分析其基因序列的同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系，為斑馬源蛔蟲的分子鑒定和分子流行學(xué)等研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株來源 2017年長(zhǎng)沙市生態(tài)野生動(dòng)物園對(duì)園區(qū)內(nèi)部分草食動(dòng)物進(jìn)行藥物驅(qū)蟲，先后在9匹斑馬糞便中發(fā)現(xiàn)線蟲，形態(tài)學(xué)初步鑒定為蛔蟲屬，用滅菌PBS清洗后分別標(biāo)記，保存于-20 ℃。

1.2 主要試劑 組織DNA提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；蛋白酶K，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；PCR試劑和DL-2 000 DNA marker，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 線粒體pcox1與pnad5基因擴(kuò)增與測(cè)序 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計(jì)擴(kuò)增蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列的引物序列：pcox1-F：5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′，pcox1-R：5′-TAAAGAAAGA-ACATAATGAAAATG-3′；pnad5-F：5′-TAG AGGGG-CTATGAATACTG-3′，pnad5-R：5′-ACGGCCATCTTGTTGACCTAATG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

將蟲體反復(fù)清洗，剪取約1.5 cm蟲體按照組織DNA提取試劑盒說明書提取蟲體核酸DNA，保存于-80 ℃。以基因組DNA為模板分別擴(kuò)增線粒體pcox1和pnad5基因序列，PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：PCR Mix 25 μL、上下游引物 2 μL(10 pmol/L)、模板DNA 4 μL和滅菌蒸餾水17 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%凝膠電泳檢測(cè)并由長(zhǎng)沙擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 線粒體pcox1和pnad5基因序列分析 應(yīng)用DNASTAR軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行拼接，從GenBank下載具有代表性的蛔目線粒體cox1和nad5基因序列，利用MegAlign軟件分析斑馬蛔蟲pcox1、pnad5序列與其他蛔蟲分離株對(duì)應(yīng)核苷酸序列同源性；應(yīng)用DnaSP 5.0軟件分析序列核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型數(shù)(H)、平均核苷酸差異(K)等特性；以旋毛蟲(Trichinellaspiralis)作為外群，采用K2P模型，利用MEGA 7.0軟件中鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建種系發(fā)育樹，并重復(fù)1 000次 自舉檢驗(yàn)(Bootstrap test)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 本試驗(yàn)中9個(gè)斑馬蛔蟲樣品(樣品編號(hào)為BM1～9)均擴(kuò)增出約450 bp和528 bp的基因片段，與預(yù)期線粒體pcox1和pnad5基因序列大小相符(圖1)，表明分別擴(kuò)增出斑馬蛔蟲線粒體pcox1和pnad5序列。

圖1 斑馬蛔蟲線粒體pcox1(A)與pnad 5(B)基因序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列特征與同源性分析 將斑馬蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列的測(cè)序結(jié)果經(jīng)校正并剔除多余序列后，9個(gè)斑馬蛔蟲分離株擴(kuò)增的線粒體pcox1和pnad5基因序列長(zhǎng)度分別為422 bp和528 bp，占cox1和nad5基因序列全長(zhǎng)的26.74%(422/1 578)和33.31%(528/1 585)，未檢測(cè)到核苷酸插入或缺失，序列中A+T平均含量分別為62.32%(263/422)和65.15%(344/528)。

同源性分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中9個(gè)斑馬蛔蟲樣品線粒體pcox1和pnad5基因序列之間的同源性分別為99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，與GenBank中登錄的馬副蛔蟲分離株(MK209654.1和MK209665.1)同源基因序列相似性分別為99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，與P.univalens分離株(KM067271.1)同源基因序列相似性分別為99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，與其他蛔蟲同源基因序列相似性均低于92.0%(pcox1)和91.2%(pnad5)。

2.3 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列遺傳多樣性分析 9個(gè)斑馬源蛔蟲樣品線粒體pcox1基因序列檢測(cè)出6個(gè)單倍型，共含有8個(gè)可變位點(diǎn)，其總單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.624和0.004 37，平均核苷酸差異(K)為1.834；而pnad5基因序列檢測(cè)出8個(gè)單倍型，共含有14個(gè)可變位點(diǎn)，其總單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為1.000和0.009 67，平均核苷酸差異(K)為4.071。結(jié)果表明斑馬蛔蟲線粒體pcox1基因序列變異程度較pnad5基因低(表1)。

表1 基于線粒體pcox1和pnad 5基因序列分析斑馬源蛔蟲遺傳多樣性

2.4 斑馬源蛔蟲線粒體pcox1和pnad5基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將斑馬源蛔蟲線粒體pcox1序列(422 bp)和pnad5序列(528 bp)串聯(lián)，利用MEGA 7.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，9個(gè)斑馬源蛔蟲分離株與已知馬副蛔蟲分離株(MK209654和MK209665)、P.univalens分離株聚為同一分支，貝氏蛔蟲屬(Baylisascarisspp.)聚為另外一個(gè)分支，馬副蛔蟲和P.univalens與貝氏蛔蟲屬所屬分支相距較近，但與其他蛔蟲所屬分支相距較遠(yuǎn)(圖2)，但本次試驗(yàn)所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹無法區(qū)分馬副蛔蟲和P.univalens。

圖2 斑馬蛔蟲與其他蛔蟲線粒體pcox1與pnad 5串聯(lián)基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

馬副蛔蟲病是馬、驢等動(dòng)物常見的寄生蟲病，可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床疾病，甚至死亡[5]。馬副蛔蟲在我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古等養(yǎng)馬業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)分布廣泛。魏梓霖等[8]調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)部分地區(qū)賽馬馬副蛔蟲感染率達(dá)4.83%，其結(jié)果與圖爾蓀·薩迪爾等[9]對(duì)新疆阿勒泰地區(qū)馬匹馬副蛔蟲感染情況基本一致，雖然其感染率相對(duì)較低，但該病對(duì)宿主危害巨大，是我國(guó)馬養(yǎng)殖過程中應(yīng)重點(diǎn)防控的寄生蟲病之一。然而，目前對(duì)于馬副蛔蟲病的研究主要集中于流行情況調(diào)查與藥物防控等研究，對(duì)該類寄生蟲的種類鑒定與遺傳進(jìn)化研究較少。

在生物進(jìn)化過程中，生態(tài)環(huán)境變化可能導(dǎo)致寄生蟲發(fā)生遺傳變異，而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定無法判定蟲株是否發(fā)生遺傳變異。線粒體DNA具有進(jìn)化速率快和母系遺傳等特點(diǎn)，可作為可靠的分子標(biāo)記應(yīng)用于寄生蟲的遺傳進(jìn)化研究中。大量研究表明，蛔蟲線粒體cox1與nad5基因序列在種內(nèi)相對(duì)保守，但也存在一定的遺傳變異[10-14]。本試驗(yàn)通過對(duì)9個(gè)斑馬源蛔蟲樣品線粒體pcox1和pnad5基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，發(fā)現(xiàn)其同源性分別為99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，與GenBank中收錄的馬副蛔蟲分離株基因序列相似性分別為99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，與P.univalens分離株基因序列相似性分別為99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，且基于pcox1和pnad5串聯(lián)基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，所有的斑馬源蛔蟲樣品與已知馬副蛔蟲和P.univalens聚為同一分支，與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)。結(jié)果表明斑馬源蛔蟲為馬副蛔蟲或P.univalens，同時(shí)也支持馬副蛔蟲與P.univalens為同一個(gè)種的觀點(diǎn)[3]，與Peng等[5]調(diào)查結(jié)果有一定差異，出現(xiàn)不同結(jié)果原因可能與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所選擇的分子標(biāo)記不同有關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)9個(gè)斑馬源蛔蟲樣品線粒體cox1和nad5基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，發(fā)現(xiàn)斑馬源蛔蟲pcox1和pnad5基因序列均存在一定的遺傳變異情況，且pnad5遺傳多樣性高于pcox1，但二者均較低。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果將斑馬源蛔蟲鑒定為馬副蛔蟲或P.univalens，可初步確定馬副蛔蟲和P.univalens為同一個(gè)種，但這兩種線蟲是否為同一個(gè)種還需要進(jìn)一步研究，如通過分析馬副蛔蟲和P.univalens全基因組序列信息等。