宋 鵬，趙付偉，劉文強(qiáng) , 王本琢，劉文華，張 燦，鄒 玲，任慧英

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.東阿阿膠股份有限公司黑毛驢研究所，山東 聊城 252200；3.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252200；4.山東省無棣縣畜牧獸醫(yī)站，山東 無棣 251900)

沙門菌(Salmonella)是革蘭陰性菌，在自然界中廣泛分布，是最為常見的食源性病原菌,全球每年因沙門菌引發(fā)的食物中毒事件位居細(xì)菌性中毒事件首位[1]。沙門菌可引起人獸共患疾病，人感染沙門菌會(huì)引起胃腸炎，出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀。在養(yǎng)殖業(yè)中沙門菌會(huì)引起豬、羊、雞、馬等多種動(dòng)物患病[2]。在驢、馬等馬屬動(dòng)物的養(yǎng)殖過程中，馬流產(chǎn)沙門菌是沙門菌病的主要病原體，可以引起妊娠母馬流產(chǎn)，同時(shí)病原菌會(huì)隨羊水、胎兒、陰道分泌物大量排出體外。病菌可通過被污染的飲水和飼料經(jīng)消化道傳播，也會(huì)通過交配的過程傳播[3]。馮培祥等[4]報(bào)道從1頭流產(chǎn)驢駒的肝臟、脾臟和肺臟、心臟及腎臟中分離到大量沙門菌，確定其為母驢流產(chǎn)的原因。每年因沙門菌感染引起的馬屬動(dòng)物流產(chǎn)給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近些年來，由于抗生素的濫用，具有多重耐藥性的沙門菌越來越多，成為食品安全和動(dòng)物疾病控制領(lǐng)域的一個(gè)新興的嚴(yán)重問題。源自豬和家禽的抗生素抗性基因可通過人獸共患病原體的轉(zhuǎn)移而威脅人類健康，并且食源性病原體中抗生素耐藥性的出現(xiàn)頻率增加[5]。趙翔等[6]報(bào)道1株多重耐藥的食源性傷寒沙門菌，對(duì)20 種抗生素中的 16 種均有耐藥性，耐藥率達(dá)80%?，F(xiàn)在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家禁止使用抗生素作為動(dòng)物飼料中的生長促進(jìn)劑，我國也明確表示藥物飼料添加劑將在2020年全部退出[7]。因此，現(xiàn)階段迫切需要尋找一種新型的抗菌制劑來應(yīng)對(duì)沙門菌病。

噬菌體具有特異性與高效性，可以快速殺傷特定的目標(biāo)菌，從而避免產(chǎn)生廣譜抗生素對(duì)腸道正常菌群的殺傷作用，并且噬菌體對(duì)具有多重耐藥性的細(xì)菌同樣具有裂解作用，對(duì)人體、動(dòng)物體以及環(huán)境不會(huì)造成危害。近年來噬菌體治療越來越受到重視[8]。本試驗(yàn)對(duì)馬流產(chǎn)沙門菌噬菌體進(jìn)行分離、純化，并測定其生物學(xué)特性，為探究噬菌體治療驢沙門菌感染提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本及菌種 分離噬菌體的樣本為養(yǎng)驢場的驢糞；馬流產(chǎn)沙門菌，由東阿阿膠股份有限公司黑毛驢研究所及聊城大學(xué)惠贈(zèng)；雞源沙門菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 馬流產(chǎn)沙門菌噬菌體的分離鑒定 以馬流產(chǎn)沙門菌分離株為宿主菌，取驢糞樣加入到200 mL LB肉湯之中，再加入馬流產(chǎn)沙門菌500 μL，混勻后37 ℃過夜培養(yǎng)，取上清10 000 r/min離心15 min，取上清過濾。然后將100 μL濾液與100 μL菌液混合，37 ℃孵育5 min，加入到上層瓊脂培養(yǎng)基混勻后鋪到底層瓊脂上，過夜培養(yǎng)，觀察噬菌斑。

摳取單個(gè)噬菌斑，放入1 mL的LB肉湯之中，37 ℃水浴10 min，然后10 000 r/min離心5 min，取上清過濾進(jìn)行10倍倍比稀釋至合適的稀釋度，通過雙層平板法[9]進(jìn)行噬菌斑的純化，連續(xù)純化3次，獲得大小、形態(tài)一致的噬菌斑。

1.2.2 噬菌體電鏡觀察 取20 μL噬菌體液滴加在銅網(wǎng)上，沉淀15 min以后用濾紙吸去多余的液體，滴加15 μL 2%的磷鎢酸染色液，染色5 min，吸出多余染液，干燥后用電子顯微鏡觀察[10]。根據(jù)命名原則對(duì)噬菌體進(jìn)行命名[11]。

1.2.3 噬菌體裂解譜的測定 采用點(diǎn)樣法[12]進(jìn)行裂解譜的測定，取100 μL菌液加入到5 mL上層瓊脂培養(yǎng)基混勻后鋪到瓊脂平板上,凝固后取噬菌體增殖液2 μL點(diǎn)到雙層平板上，37 ℃培養(yǎng)，觀察噬菌斑，計(jì)算裂解譜。

1.2.4 噬菌體感染復(fù)數(shù)(MOI)的測定 將噬菌體與宿主菌分別按照不同MOI混合后，加入裝有5 mL LB的試管中，在37 ℃振蕩培養(yǎng)至澄清后取出，然后10 000 r/min離心5 min，取上清過濾后進(jìn)行10倍倍比稀釋至合適的稀釋度，雙層平板法測噬菌體效價(jià)。

1.2.5 噬菌體對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 取4 mL的噬菌體增殖液置于紫外燈下40 cm處照射，每10 min取200 μL噬箘體增殖液，然后進(jìn)行稀釋，用雙層平板法測效價(jià)。根據(jù)效價(jià)隨時(shí)間的變化繪制變化曲線。

1.2.6 噬菌體對(duì)氯仿的穩(wěn)定性 向5 mL噬菌體增殖液之中加入200 μL的氯仿，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，加入等量的LB。在37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)30 min，雙層平板法測效價(jià)。

1.2.7 噬菌體對(duì)溫度的穩(wěn)定性 取200 μL的噬箘體液，分別在37、40、50、60、70 ℃和80 ℃水中放置20、40 min和60 min。雙層平板法測定效價(jià)，根據(jù)不同的時(shí)間溫度繪制效價(jià)的變化曲線。

1.2.8 噬菌體的pH穩(wěn)定性 取噬菌體增殖液500 μL 加入到4.5 mL不同pH的LB肉湯中，在37 ℃ 分別作用1、2 h和3 h后將pH調(diào)回7.0，雙層平板法測效價(jià)。繪制噬菌體效價(jià)在不同pH下隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.9 一步生長曲線的測定 按MOI為10,各取200 μL的噬菌體液與菌液混合，37 ℃孵育5 min，取出后高速離心棄上清，用LB洗滌高速離心的混合物，重復(fù)2次。然后置于含有5 mL LB肉湯之中37 ℃ 振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在第1小時(shí)每隔5 min，第2小時(shí)每隔20 min，第3～4小時(shí)每隔30 min，取出200 μL噬菌體增殖液，10 000 r/min離心5 min后取上清稀釋，雙層平板法測效價(jià)，繪制效價(jià)隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.10 噬菌體對(duì)病原菌的體外裂解試驗(yàn) 按照MOI為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1和0.000 01比例各取50 μL的菌液與噬菌體增殖液加入到96孔板之中，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照與陽性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)，前3 h每隔30 min，后6 h每隔1 h取樣。讀取OD630值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD630值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離 以馬流產(chǎn)沙門菌S2為宿主菌進(jìn)行噬菌體的分離，分離到1株噬菌體。經(jīng)過3代純化，噬菌體在雙層平板上形成直徑2 mm左右的透明規(guī)則噬菌斑(圖1)。噬菌體效價(jià)為2.8×109PFU/mL。

圖1 噬菌體的噬斑

2.2 噬菌體電鏡觀察 該噬菌體電鏡下觀察為長尾噬菌體，由頭部和尾部組成，頭部直徑約為80 nm，尾部約為160 nm。根據(jù)噬菌體命名規(guī)則，將該株噬菌體命名為vB-SabS-Sds2。

2.3 噬菌體裂解譜的測定 分離到的噬菌體vB-SabS-Sds2，對(duì)3株馬流產(chǎn)沙門菌的裂解率為100%，對(duì)17株雞白痢沙門菌裂解率為6%，對(duì)5株其他雞源沙門菌均不可裂解。

2.4 噬菌體最適MOI的測定 由圖2可知，MOI為0.000 1時(shí)，噬菌體侵染宿主菌后裂解產(chǎn)生子代噬菌體效價(jià)最高，達(dá)到3.23×109PFU/mL，噬菌體vB-SabS-Sds2的最適MOI為0.000 1。

圖2 vB-SabS-Sds2的MOI 測定結(jié)果

2.5 噬菌體對(duì)紫外線的穩(wěn)定性 噬菌體效價(jià)為109PFU/mL時(shí)，經(jīng)過紫外線連續(xù)照射20 min后，噬菌體效價(jià)下降大約1個(gè)數(shù)量級(jí)，連續(xù)照射60 min后，噬菌體效價(jià)下降大約2個(gè)數(shù)量級(jí)，保持在107PFU/mL。連續(xù)照射120 min后，噬菌體效價(jià)跌至2.03×105PFU/mL。

2.6 噬菌體對(duì)氯仿的穩(wěn)定性 經(jīng)5%氯仿作用30 min后，對(duì)照組的效價(jià)為1.9×109PFU/mL，試驗(yàn)組的效價(jià)為9×108PFU/mL。噬菌體的活性基本不受氯仿影響。

2.7 噬菌體不同溫度穩(wěn)定性試驗(yàn) 噬菌體效價(jià)為2.9×109PFU/mL時(shí)，噬菌體在溫度40 ℃和50 ℃時(shí)作用1 h仍能保持原有活性。60 ℃作用1 h后效價(jià)下降到1.17×106PFU/mL。70 ℃作用1 h后效價(jià)下降到4×104PFU/mL。80 ℃作用20 min已經(jīng)完全失活。

2.8 噬菌體的pH穩(wěn)定性 噬菌體效價(jià)為2.6×109PFU/mL時(shí)，噬菌體在pH為4～11時(shí)作用3 h后基本可以保持原有的活性；在pH為2時(shí)作用1 h 就完全失活；在pH為3時(shí)作用1 h效價(jià)降至2.85×104PFU/mL，2 h完全失活；在pH為13時(shí)作用3 h完全失活。

2.9 一步生長曲線 噬菌體vB-SabS-Sds2的一步生長曲線如圖3所示。潛伏期為10 min，爆發(fā)期為30 min，爆發(fā)量為8.6 PFU/cell。80 min之后效價(jià)趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在109PFU/mL左右。

圖3 噬菌體vB-SabS-Sds2的一步生長曲線

2.10 噬菌體對(duì)病原菌的體外裂解試驗(yàn) 陽性對(duì)照組(只加菌液)的OD630值始終持續(xù)上升，陰性對(duì)照組(只加噬菌體)的OD630值始終保持不變。噬菌體與宿主菌按照不同的感染復(fù)數(shù)混合后，出現(xiàn)不同程度的細(xì)菌增殖抑制現(xiàn)象。感染復(fù)數(shù)越大，OD630值下降越快，MOI為10時(shí)，細(xì)菌OD630值下降最快，并保持9 h內(nèi)不再渾濁(圖4)。

圖4 噬菌體vB-SabS-Sds2的體外裂解試驗(yàn)

3 討論

由于噬菌體能特異高效的裂解細(xì)菌，因此具有廣闊的應(yīng)用前景，可能取代抗生素來治療細(xì)菌性疾病[13]。在臨床應(yīng)用時(shí)，由于噬菌體的高度特異性，為了保證噬菌體治療的效果，往往將多個(gè)具有寬裂解譜的噬菌體配伍，制成噬菌體雞尾酒制劑來用于治療[8]。本試驗(yàn)分離的噬菌體對(duì)分離到的3株馬流產(chǎn)沙門菌均能裂解，裂解率達(dá)到了100%，由于噬菌體的高度特異性，該株噬菌體對(duì)雞源的沙門菌裂解能力不強(qiáng)，22株菌中僅可裂解1株。

在噬菌體制劑的實(shí)際應(yīng)用過程中不同的溫度、pH和紫外線會(huì)對(duì)噬菌體的活性產(chǎn)生影響，對(duì)不同溫度、pH和紫外線的耐受程度是評(píng)價(jià)噬菌體臨床應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)[14]。噬菌體vB-SabS-Sds2在40 ℃與50 ℃時(shí)均可保持原有的效價(jià)，效價(jià)變化不大。在60 ℃下作用1 h，效價(jià)下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)，70 ℃時(shí)經(jīng)過1 h噬菌體仍可保持效價(jià)在105PFU/mL左右，在80 ℃時(shí)該噬菌體徹底失活。由于在實(shí)際應(yīng)用過程中現(xiàn)實(shí)環(huán)境不會(huì)達(dá)到這么高的溫度，因此室溫基本不會(huì)對(duì)噬菌體vB-SabS-Sds2造成影響[15]。該噬菌體在pH為3～13時(shí)可保持基本穩(wěn)定，在pH為3時(shí)作用1 h效價(jià)仍可保持在104PFU/mL。相比較于李涵依等[16]報(bào)道的雞白痢沙門菌O12噬菌體(在pH為5～7時(shí)保持穩(wěn)定，溫度50 ℃以下時(shí)保持穩(wěn)定)，該噬菌體的適用范圍更廣。為了保護(hù)噬菌體在酸性環(huán)境中的活性，Atterbury等[17]建議噬菌體制劑在臨床應(yīng)用過程中可與CaCO3配合使用以減少胃酸對(duì)噬菌體的影響。該噬菌體經(jīng)過紫外線照射2 h之 后，效價(jià)可保持在105PFU/mL，表明噬菌體vB-SabS-Sds2對(duì)紫外線較為敏感。不同的噬菌體增殖周期不同，裂解周期短的噬菌體能更好地控制細(xì)菌增殖[18]。該噬菌體潛伏期為10 min，相較于包紅朵等[8]報(bào)道的噬菌體PA13076的潛伏期20 min，該噬菌體潛伏期更短，能更加迅速的裂解細(xì)菌。

2006年以來，歐盟各國已經(jīng)全面禁止在飼料中添加抗生素，2016年農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第2428號(hào)公告,公告決定停止硫酸黏菌素用于動(dòng)物促生長，2017年農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃(2017—2020年)》，藥物飼料添加劑將在2020年全部退出；2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又組織制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案(2018—2021年)》，既要做到飼料端禁抗,又要做到養(yǎng)殖端減抗[19]。飼用抗生素的禁用是必然的發(fā)展趨勢,“替抗日糧”、“無抗日糧”已成為行業(yè)熱點(diǎn)之一[20]。噬菌體作為一種生物制劑可以高效的特異性裂解宿主菌，并且不會(huì)對(duì)其他正常細(xì)菌造成任何的負(fù)面影響[21],噬菌體治療成為替代抗生素治療細(xì)菌感染的一種新的治療方式。馬流產(chǎn)沙門菌能引起馬、驢等動(dòng)物發(fā)生沙門菌導(dǎo)致的流產(chǎn)，能引起地方性流行，易感性馬群、驢群一旦傳入此病，則可引起母馬及母驢暴發(fā)性大批流產(chǎn)，造成巨大的損失[22]。本試驗(yàn)篩選出的噬菌體vB-SabS-Sds2宿主譜廣，增殖迅速，在治療馬流產(chǎn)沙門菌或其他沙門菌感染方面具有巨大的潛力。