黃 新，韓猛立，張星星，張 賓，汪 保，吳桐忠，晁旭東，何立雄，韓文國(guó)，蒲新竹，陳朝陽(yáng)，羅文毅，彭 劍，何延華，鐘發(fā)剛

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 可克達(dá)拉 835219；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師181團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 巴里巴蓋 836001；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師71團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 新源 835801；5.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師70團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 伊寧 835116)

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是危害我國(guó)極為嚴(yán)重的人獸共患傳染病，該病不但嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全，而且制約了牛羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外主要采取撲殺和免疫預(yù)防的措施防控該病。我國(guó)已出臺(tái)以疫苗免疫為主的防控策略，各地疫苗廣泛的使用在防控布病中發(fā)揮了重要的作用[3-5]，但由于各類疫苗、免疫方式及其免疫程序的不一，以及免疫前陽(yáng)性淘汰撲殺機(jī)制不健全，造成各地的免疫覆蓋范圍和免疫效果差異大，導(dǎo)致布魯氏菌病自然感染和免疫牛羊共存，患病動(dòng)物無法識(shí)別剔除。當(dāng)前，較大的疫情雖有所減少，但感染畜潛在危害短期內(nèi)難以遏制，廣大牧民感染的風(fēng)險(xiǎn)長(zhǎng)期存在[6-7]。布病M5和S2株疫苗在我國(guó)廣泛應(yīng)用，S2株主要口服免疫，M5株主要皮下注射免疫[8-10]。20世紀(jì)70年代，我國(guó)青海和新疆在條件較差的山區(qū)都使用M5疫苗開展過氣霧免疫工作，也取得了一定的效果[11-13]。黏膜免疫是模擬自然感染途徑，直接刺激呼吸道和消化道黏膜下豐富的淋巴組織產(chǎn)生大量免疫活性細(xì)胞和抗體，切斷病原微生物入侵機(jī)體[14]。本課題組借鑒M5疫苗氣霧免疫方法，研制密閉式氣霧免疫裝置，使用致病力更弱的布魯氏菌S2疫苗株，開展布魯氏菌疫苗氣霧免疫試驗(yàn)，探究不同免疫劑量后布病抗體消長(zhǎng)規(guī)律。試驗(yàn)的開展為氣霧免疫防控羊布魯氏菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 布魯氏菌疫苗 布魯氏菌病活疫苗(S2株)為新疆天康股份有限公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號(hào)：2017009)，疫苗中活菌數(shù)不低于1×1010菌落總數(shù)/毫升(Colony-forming units/mL，CFU/mL)。

1.2 抗體檢測(cè)試劑 虎紅平板凝集抗原(IDEXX，SN:405-100)及陰陽(yáng)性血清、試管凝集抗原(IDEXX，SN:214)及陰陽(yáng)性血清，均為北京愛德士元亨生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 氣霧免疫裝置 該裝置為2016年本課題組設(shè)計(jì)研發(fā)，發(fā)明專利：一種家畜免疫消毒方法及專用裝置(CN201710131959)。通過該裝置進(jìn)行布魯氏菌氣霧免疫。

1.4 免疫羊群 試驗(yàn)羊群為未免疫過布魯氏菌疫苗，虎紅平板凝集試驗(yàn)(Rose bengal plate agglutination test，RBPT)和試管凝集試驗(yàn)(Standard-tube agglutination test，SAT)檢測(cè)陰性的健康綿羊，羔羊?yàn)?～4月齡，成年羊?yàn)?歲，均為新疆阿勒泰本地雜交羊。

1.5 免疫方法 口服免疫使用專用口服投服器，一人保定羊，一人實(shí)施免疫；氣霧免疫使用課題組自主研發(fā)的氣霧免疫裝置實(shí)施分批免疫[15]。

1.6 試驗(yàn)分組 將免疫羊群按照氣霧免疫組和口服免疫組分為2個(gè)大組，試驗(yàn)期為1年。試驗(yàn)分組見表1?？诜庖呓M：免疫劑量(Immunizing dose, IMD)為1×1010CFU，口服器投服100只羊，根據(jù)年齡分為2個(gè)小組，即成年羊口服免疫組和羔羊口服免疫組。氣霧免疫組：633只羊按免疫劑量分成7個(gè)小組，使用氣霧免疫裝置分批次進(jìn)行免疫，劑量分別為1×1010、8×109、6×109、4×109、2×109、1×109CFU和5×108CFU，每組86～95只羊，各試驗(yàn)組羊只分別隔離飼養(yǎng)。

表1 免疫分組

1.7 血清學(xué)檢測(cè) 采集疫苗免疫后的第30、60、90、120天和第320天血清，進(jìn)行RBPT和SAT檢測(cè)。檢測(cè)方法和判定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB—18646(2002)。

2 結(jié)果

2.1 口服免疫后抗體陽(yáng)性率及其消長(zhǎng)曲線 免疫后30～320 d羔羊和成年羊RBPT和SAT陽(yáng)性率結(jié)果如表2所示，羔羊在30 d(RBPT:38.00%，SAT:32.00%)，成年羊在30 d(RBPT:72.00%，SAT:68.00%)，均達(dá)到最高值，兩者的RBPT和SAT檢測(cè)陽(yáng)性率比較，成年羊比羔羊分別高出34.00%和36.00%。羔羊和成年羊在免疫后60、90 d和120 d陽(yáng)性率都降低，成年羊的陽(yáng)性率分別高出羔羊30.00%、12.00%和2.00%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，RBT與SAT方法檢測(cè)陽(yáng)性率數(shù)差異不顯著(P>0.05)。如圖1所示，根據(jù)羔羊和成年羊口服免疫SAT檢測(cè)結(jié)果，建立30～320 d抗體消長(zhǎng)曲線，成年羊和羔羊抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)基本一致，羔羊及成年羊抗體陽(yáng)性率均在免疫后30 d達(dá)到峰值，羔羊的峰值比成年羊低36.00%，30～60 d下降較快，90～120 d下降緩慢。

表2 口服免疫后30～320 d的羔羊、成年羊抗體陽(yáng)性率變化

圖1 口服免疫后30～320 d的羔羊、成年羊抗體陽(yáng)性率消長(zhǎng)曲線

2.2 氣霧免疫后羔羊抗體陽(yáng)性率及其消長(zhǎng)曲線 如表3所示，免疫后30 d各劑量組陽(yáng)性率最高僅為40.00%，60 d陽(yáng)性率降至20.00%，90 d后降至10.00%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，RBT與SAT方法檢測(cè)布病抗體陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)，不同免疫劑量下相同免疫后時(shí)間點(diǎn)的抗體陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。如圖2所示，使用SAT陽(yáng)性率結(jié)果建立免疫后30～320 d抗體消長(zhǎng)曲線，各劑量組抗體陽(yáng)性率在30 d時(shí)達(dá)到峰值，30～120 d快速下降，120 d后 SAT檢測(cè)陽(yáng)性率降至0。

圖2 不同劑量氣霧免疫后30～320 d的羔羊抗體陽(yáng)性率消長(zhǎng)曲線

表3 不同劑量氣霧免疫后30～320 d的羔羊抗體陽(yáng)性率變化

2.3 氣霧免疫后成年羊抗體陽(yáng)性率及其消長(zhǎng)曲線 如表4所示，與羔羊免疫劑量相同，6個(gè)組(除5×108CFU組)，免疫后30 d RBPT和SAT平均陽(yáng)性率分別為95.47%和86.84%(RBPT：94.67%～96.15%；SAT:84.81%～88.50%)，比成年羊口服免疫組30 d RBPT和SAT抗體陽(yáng)性率分別高出23.47%和18.84%；免疫后60 d、90 d、120 d和320 d各組陽(yáng)性率分別降至53.33%、24.39%、10.00%和5.00%；5×108CFU組30 d陽(yáng)性率較低(RBPT:48.70%，SAT:44.73%)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)：RBT與SAT方法檢測(cè)布病抗體陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)，在免疫后30 d和60 d，5×108CFU組SAT抗體陽(yáng)性率與其他6個(gè)組差異極顯著(P<0.01)。如圖3所示，使用成年羊SAT陽(yáng)性率結(jié)果，建立免疫后30～320 d抗體消長(zhǎng)曲線，各劑量組免疫后抗體陽(yáng)性率快速升高，到30 d時(shí)達(dá)到峰值，30～90 d抗體陽(yáng)性率快速下降，90～320 d下降較慢。5×108CFU組與其他6個(gè)組相比較，30 d曲線波峰較低，30 d后的曲線下降趨勢(shì)較一致。

圖3 不同劑量氣霧免疫后30～320 d的成年羊抗體陽(yáng)性率消長(zhǎng)曲線

表4 不同劑量氣霧免疫后30～320 d的成年羊抗體陽(yáng)性率變化

3 討論

我國(guó)老一輩獸醫(yī)工作者，在40年前非常簡(jiǎn)陋的設(shè)施和條件情況下，開展了布魯氏菌氣霧免疫的多項(xiàng)研究和免疫工作，取得了較好的效果[11-13]，本課題組借鑒這一思路，自行設(shè)計(jì)研制了一套氣霧免疫裝置，使用毒力更低的布魯氏菌S2疫苗開展氣霧免疫研究。為了方便運(yùn)輸，使用集裝箱為免疫倉(cāng)，同時(shí)增加消毒噴淋裝置、負(fù)壓裝置和升降裝置等保障整個(gè)免疫過程順利進(jìn)行，同時(shí)盡可能減少密封倉(cāng)疫苗的外泄，確保免疫過程的操作者及牧工的安全。

黏膜免疫是直接應(yīng)用疫苗到黏膜表面，如消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜，誘導(dǎo)局部黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。黏膜免疫最大的優(yōu)點(diǎn)是可以模擬自然感染途徑，直接刺激呼吸道和消化道黏膜下豐富的淋巴組織產(chǎn)生大量免疫活性細(xì)胞和抗體，直接切斷病原微生物入侵機(jī)體的途徑[16-17]，因此，黏膜免疫對(duì)阻止由黏膜入侵機(jī)體內(nèi)的病原微生物效果較好。布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，病菌自皮膚或黏膜侵入機(jī)體，黏膜免疫為其最佳的選擇。

通過口服與氣霧免疫后30 d抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率比較，成年羊氣霧免疫的轉(zhuǎn)陽(yáng)率更高，比口服免疫平均高20.00%～30.00%。成年羊氣霧免疫后除免疫劑量5×108CFU組外，30 d的轉(zhuǎn)陽(yáng)率均在較高水平，表明氣霧免疫在使用1×109～1×1010CFU劑量的疫苗，均可達(dá)到較高抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率。這與疫苗口服后不能耐受胃酸和各種蛋白酶的降解，抗原吸收較少有關(guān)。而通過呼吸道免疫具有抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)閾值低、抗原用量少、不受消化酶影響的特點(diǎn)[18]。

本試驗(yàn)采用RBT與SAT兩種方法對(duì)免疫后抗體進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性率變化趨勢(shì)一致，差異不顯著。使用氣霧免疫的各組抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)雖然相同，但是5×108CFU組陽(yáng)性率較低，與其他6個(gè)組在免疫后30 d和60 d差異較顯著，這可能與免疫劑量過低，不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫有關(guān)[19-20]。分別使用口服和不同梯度氣霧劑量免疫羔羊，免疫后30 d的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率較低(30.00%)，這可能與幼畜的免疫及生殖器官尚未發(fā)育成熟有關(guān)[19-20]，所以不建議幼畜過早免疫布魯氏菌疫苗。