李秀娟，郭 召，趙 遠(yuǎn)，張小軍，李金波，李富金

(1.齊魯動物保健品有限公司，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省諸城市畜牧發(fā)展中心，山東 諸城 262200)

雞傳染性鼻炎是由副雞禽桿菌所引起雞的急性呼吸系統(tǒng)疾病，主要癥狀為鼻腔與鼻竇發(fā)炎，流鼻涕，臉部腫脹和打噴嚏。我國1986年首次報道該病，自1987年后，許多雞場都有該病發(fā)生，發(fā)病率越來越高，目前在中國各地都有流行。青年雞發(fā)病表現(xiàn)為雞的生長發(fā)育不良，雞群淘汰率明顯增加，產(chǎn)蛋雞發(fā)病表現(xiàn)為產(chǎn)蛋減少或者停止，一般產(chǎn)蛋下降10%～40%，高峰期發(fā)病產(chǎn)蛋可下降70%。一旦發(fā)病，雞蛋品質(zhì)下降，不能留作種用，而且該病很難根治，容易復(fù)發(fā)，藥費增加，使養(yǎng)殖者經(jīng)濟(jì)效益損失嚴(yán)重[1-6]。為了解近幾年國內(nèi)該病的發(fā)生和流行情況，筆者對2014年1月—2019年12月6年間送檢齊魯動物保健品有限公司臨床檢測中心的127例雞傳染性鼻炎病例進(jìn)行流行病學(xué)統(tǒng)計，分析該病流行情況及變化，為科學(xué)防控該病提供臨床數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2014年1月1日—2019年12月31日6年間，來源于山東、河北、江蘇、浙江、陜西、甘肅、寧夏、兩湖及東北三省等國內(nèi)各地送檢的1 399例雞的病例，經(jīng)臨床診斷、病理剖檢、實驗室細(xì)菌分離、PCR檢測，確診127例雞傳染性鼻炎,47株分離菌做了藥敏試驗，71株分離菌成功測序，進(jìn)行了血清型比對分析。

1.1.2 培養(yǎng)基 副嗜血培養(yǎng)基(含輔酶)、營養(yǎng)瓊脂平板，由齊魯動物保健品有限公司研究所自制。

1.1.3 副雞禽桿菌特異性PCR引物 副雞禽桿菌特異PCR引物，由齊魯動物保健品有限公司研究所自制。

1.1.4 藥敏試紙 丁胺卡那霉素、頭孢喹肟、頭孢氨芐、阿莫西林、阿莫西林+棒酸、多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、甲氧嘧啶、壯觀霉素、林可霉素、紅霉素、多黏菌素共16種藥物的藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷 通過對送檢病死雞發(fā)病背景調(diào)查及外觀檢查，了解發(fā)病案例的品種、發(fā)病時間、日齡、用藥情況、主要臨床表現(xiàn)及免疫背景。

1.2.2 細(xì)菌分離 將送檢病死雞頭外部用消毒液消毒，用無菌剪刀剪開，暴露出鼻竇腔，利用無菌操作術(shù)用接種環(huán)蘸取竇腔內(nèi)黏液、干酪樣分泌物，劃線接種于副嗜血瓊脂平板，放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)18～48 h，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.3 PCR檢測 以純培養(yǎng)菌液為模板，參考Chen等[7]設(shè)計的種特異性PCR引物進(jìn)行鑒定。引物序列如下：P1：5′-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGA AT-3′；P2：5′-CAAGGTATCGATCGTCTC-TCTACT-3′。

1.2.4 血清型分析 參考文獻(xiàn)[8]合成1對引物，擴(kuò)增血凝素HMTp120高變區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小約為1.6 kb，引物序列如下：P3：5′-GATGGCACAATTACATTTACA-3′；P4：5′-ACCTTGAGTGCTAGATGC-TGTAGGTGC-3′。將PCR產(chǎn)物連同引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對初步確定血清型。參照文獻(xiàn)[9-11]中報道的血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)進(jìn)行驗證。

1.2.5 藥敏試驗 對所分離出的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(紙片法)。將分離純化的細(xì)菌接種、劃線在副嗜血瓊脂平板，再將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～48 h，觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 病雞鼻孔先流出清液以后轉(zhuǎn)為漿液黏性分泌物，有時打噴嚏，眼結(jié)膜炎，面部浮腫，一側(cè)或者兩側(cè)眼瞼腫脹，如炎癥蔓延至下呼吸道，則呼吸困難,病雞常搖頭欲將呼吸道內(nèi)的黏液排出,并有啰音，咽喉亦可積有分泌物的凝塊，最后常窒息而死。公雞肉髯常見腫大。病雞精神差，縮頭，呆立，食欲及飲水減少，或有下痢(綠色)，體重減輕。仔雞生長不良，成年母雞產(chǎn)蛋減少或者停止。本病發(fā)病率雖高，但死亡率較低，尤其是在流行的早、中期雞群很少有死雞出現(xiàn)。但在雞群恢復(fù)階段，死淘增加，但不見死亡高峰，死雞多屬繼發(fā)感染所致。

2.2 病理變化 常見卡他性結(jié)膜炎，結(jié)膜充血腫脹，臉部及肉髯皮下水腫。主要病變?yōu)楸乔缓透]腔黏膜呈急性卡他性炎，黏膜充血腫脹，表面覆有大量黏液，竇內(nèi)有滲出物凝塊，后成為干酪樣壞死物。嚴(yán)重時可見氣管黏膜炎癥，偶有肺炎及氣囊炎。

2.3 菌株分離鑒定情況 經(jīng)臨床癥狀、病理變化及實驗室PCR診斷，確診127例雞傳染性鼻炎病例，并分離出71株副雞禽桿菌，經(jīng)種特異性PCR擴(kuò)增，確認(rèn)均為副雞禽桿菌。

2.4 不同年份發(fā)病數(shù)量統(tǒng)計 通過對2014年1月1日—2019年12月31日本研究中心檢測的127例雞傳染性鼻炎病例進(jìn)行統(tǒng)計，同時計算雞傳染性鼻炎病例與本年度接診病例數(shù)所占比例，結(jié)果見表1：2014年、2015年發(fā)病率為3.8%和4.0%，2016年、2017年發(fā)病率為9.2%和9.5%，2018年、2019年發(fā)病率為11.5%和13.1%，發(fā)病率逐年增高。

表1 不同年份雞傳染性鼻炎病例數(shù)量統(tǒng)計

2.5 不同季節(jié)病例統(tǒng)計 通過對127個病例發(fā)病季節(jié)/月份進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表2：春季39例，占比30.7%；夏季25例，占比19.7%；秋季22例，占比17.3%；冬季41例，占比32.3%，冬春季節(jié)發(fā)病占全年的63%，夏秋季發(fā)病占全年的37%，一年四季均能發(fā)生，多發(fā)于冬春兩季，但四季間差異不太明顯。

表2 不同季節(jié)雞傳染性鼻炎病例數(shù)量統(tǒng)計

2.6 不同日齡病例數(shù)統(tǒng)計 通過對127個病例發(fā)病日齡段進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表3：本病發(fā)生于各種日齡段的雞，1～60日齡段病例10例，占比7.9%；61～120日齡段26例，占比20.5%；121～240日齡段47例，占比37.0%，占比最高；241～360日齡段35例，占比27.5%；361～450日齡段7例，占比5.5%；450日齡以上僅2例，占比1.6%。剛開產(chǎn)及產(chǎn)蛋高峰期的雞群感染較為嚴(yán)重，發(fā)病后損失也最大，其次是61～120日齡段，即疫苗二免前后發(fā)病也比較多，其中61～360日齡段病例占總病例的85%。

表3 不同日齡段雞傳染性鼻炎病例數(shù)量統(tǒng)計

2.7 藥敏試驗 127個雞傳染性鼻炎確診病例，有47株分離菌進(jìn)行了16種藥物的藥敏試驗，結(jié)果見表4：沒有1種藥物對所有試驗的47株分離菌均敏感，其中丁胺卡那霉素、壯觀霉素及新霉素敏感性最好，不敏比例≤27.7%；分離菌對林可霉素、諾氟沙星及甲氧嘧啶則表現(xiàn)出嚴(yán)重耐藥，不敏比例≥97.9%。

表4 藥敏試驗結(jié)果

2.8 感染及混合感染病例數(shù)統(tǒng)計 通過對127個病例混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表5：單純副雞禽桿菌病例61例，占比48.0%；其次是副雞禽桿菌與大腸桿菌混合感病例24例，占比18.9%；副雞禽桿菌與鼻氣管炎鳥桿菌/鏈球菌/葡萄球菌/綠膿桿菌等細(xì)菌混合感染13例，占比11.2%；與H9亞型禽流感病毒/傳染性喉氣管炎病毒/傳染性支氣管炎病毒等病毒混合感染11例，占比8.7%；與支原體混合感染有2例，占比1.6%；副雞禽桿菌與大腸桿菌、鼻氣管炎鳥桿菌或其他病原等3種病原以上混合感染16例，占比12.6%，混合感染占比52.0%。

表5 雞傳染性鼻炎病例混合感染情況統(tǒng)計

2.9 2014—2019年6年間流行血清型統(tǒng)計 分離的71株副雞禽桿菌經(jīng)血凝素高變區(qū)序列擴(kuò)增及分析，并經(jīng)血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)方法驗證，結(jié)果見表6：近6年分離菌B型最多，有31株，占比45.1%；其次是A型，有24株，占比33.8%；C型有15株，占比21.1%。2014—2017年間A型5株、B型18株、C型1株，以B型為主；2018—2019年間A型19株、B型14株、C型14株，3種血清型差異不大。

3 討論

通過對2014—2019年間接診的127例雞傳染性鼻炎病例的統(tǒng)計分析，每年該病的發(fā)病數(shù)占接診雞病總數(shù)的比例分別為3.8%、4.0%、9.2%、9.5%、11.5%和13.1%，發(fā)病率呈逐年增高趨勢；一年四季均發(fā)，以冬春季節(jié)為主，占病例數(shù)的63%，這一點與以往材料介紹的寒冷秋冬季為主有所不同[12-14]，且發(fā)病季節(jié)性越來越不明顯；發(fā)病日齡以初產(chǎn)雞及產(chǎn)蛋高峰期雞為主，其次是青年雞，雛雞及老齡雞發(fā)病率相對較低，該情況也與文獻(xiàn)報道[15]日齡越大發(fā)病率越高、發(fā)病越嚴(yán)重的規(guī)律有所不同。

副雞禽桿菌對多種抗菌藥物均產(chǎn)生了一定耐藥性，其中對丁胺卡那霉素、壯觀霉素及新霉素敏感性最好，對林可霉素、諾氟沙星及甲氧嘧啶則表現(xiàn)出嚴(yán)重耐藥。各地分離菌株不同，對抗菌藥物的敏感性也有差異，可能與養(yǎng)殖場用藥習(xí)慣有關(guān)，在臨床上反復(fù)發(fā)病的場可根據(jù)實驗室藥敏結(jié)果，選擇敏感藥物聯(lián)合使用。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，實驗室藥敏結(jié)果與臨床用藥也有差異，如實驗室檢測分離菌對磺胺類藥物普遍不敏感，但臨床應(yīng)用廣泛，反饋效果良好。在病原分離過程中發(fā)現(xiàn)，利用抗菌藥治療后雞群的病料，用PCR檢測陽性，但很難分離到活菌，因此，本病病原分離最好在使用抗菌藥之前進(jìn)行[16]。

單純副雞禽桿菌感染僅占48%，臨床上副雞禽桿菌常與大腸桿菌、鼻氣管炎鳥桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌及支原體混合感染；雞群有H9亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒及傳染性支氣管炎病毒等病毒感染時，也會繼發(fā)副雞禽桿菌感染；二重或者多重混合感染比例可達(dá)52%。臨床追蹤調(diào)查顯示，單純副雞禽桿菌感染防控比較容易，但如有混合感染，特別是有病毒性病原感染時，往往病程長、損失大。

雞傳染性鼻炎的病原存在A、B型和C型3個血清型，本試驗從127例病例中分離定型了71株副雞禽桿菌，近6年B型占有優(yōu)勢，占比45.1%，其次是A型，占比33.8%，C型從2018年檢出數(shù)逐年增多。B型2017年檢出數(shù)最多，近幾年逐年減少，2019年以A型和C型為主。同一病例中分離到不同血清型的菌株案例極少。

雞傳染性鼻炎的預(yù)防以疫苗接種為主，資料顯示，副雞禽桿菌A、B型和C型3個血清型之間免疫交叉保護(hù)不好，而目前國內(nèi)3種血清型均時有發(fā)生，且逐年變化，單一血清型疫苗保護(hù)效果有限，已有廠家提供包含A、B、C三種血清型的三價滅活疫苗，所用佐劑有鋁膠佐劑和油苗佐劑，臨床應(yīng)用效果反饋：鋁膠佐劑苗應(yīng)激小，保護(hù)效果產(chǎn)生快，但維持期短，常用于初免或者緊急免疫；油佐劑鼻炎苗，副反應(yīng)大，但免疫效果好，免疫保護(hù)期長，2種佐劑疫苗聯(lián)合應(yīng)用可取得良好防控效果。由于規(guī)?；笮碗u場常常多個年齡段雞同時存在，雞群免疫保護(hù)期長短不一，菌苗的保護(hù)率及維持時間均較病毒苗低，一旦暴發(fā)此病后，整個雞群的發(fā)病時間前后不一，循環(huán)發(fā)生，使預(yù)防、治療效果均受到了一定的限制，整個場區(qū)“一刀切式”全群緊急免疫，雖然費用大，但可以短時間內(nèi)有效控制疫情。