武乃雯，陳 鵬，朱春燕，劉 凱 , 程 佳，周 曼，韓 博，高 健

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 青浦 201708；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

奶牛乳房炎與營(yíng)養(yǎng)代謝病、肢蹄病并稱奶牛三大疾病，雖不造成大批畜群死亡，但對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的影響不可忽視。一方面使用抗生素造成的棄奶、治療產(chǎn)生的費(fèi)用和隨之而來的淘汰率影響?zhàn)B殖收益，另一方面使奶牛的生產(chǎn)性能降低，原料奶品質(zhì)受損，甚至危害人類健康。

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，S.agalactiae)屬于革蘭陽(yáng)性B群鏈球菌，是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌，分離率較高[1]。無(wú)乳鏈球菌引起的乳房炎通常表現(xiàn)為隱性乳房炎或較為溫和的臨床型乳房炎，通常表現(xiàn)為乳房腫脹，偶有全身發(fā)熱、泌乳停止等現(xiàn)象，故較難診斷而導(dǎo)致慢性感染，危害極大[2]。無(wú)乳鏈球菌是造成大罐奶體細(xì)胞數(shù)上升(>20萬(wàn)個(gè)/mL)的主要致病菌，甚至在某些奶牛場(chǎng)的大罐奶體細(xì)胞數(shù)為10萬(wàn)個(gè)/mL時(shí)也能檢測(cè)出無(wú)乳鏈球菌[3]。無(wú)乳鏈球菌性乳房炎在經(jīng)濟(jì)上的最大損失為奶牛乳產(chǎn)量下降，感染乳區(qū)的產(chǎn)奶量通常會(huì)下降40%，甚至更多。且隨著體細(xì)胞數(shù)升高，牛奶干物質(zhì)(如乳糖和酪蛋白等)比例下降，直接導(dǎo)致牛乳品質(zhì)下降[3-4]。無(wú)乳鏈球菌性乳房炎通常在擠奶廳中傳播，擠奶機(jī)、擠奶工的手、乳頭清潔毛巾或紙巾等均可作為傳播媒介[3]。然而，近年來研究顯示，無(wú)乳鏈球菌的來源也可能是環(huán)境，病原體也可能存在于糞便和墊料中，進(jìn)入奶牛乳房?jī)?nèi)引發(fā)感染[5-6]。

為了探索北方某奶牛場(chǎng)無(wú)乳鏈球菌的傳播途徑，本試驗(yàn)對(duì)該奶牛場(chǎng)奶樣、糞便、墊料、口腔、奶牛乳頭末端皮膚、擠奶員手臂等位點(diǎn)采樣，共采集625份樣品，進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌的分離培養(yǎng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析、解讀，得出其在奶牛群中的傳播特征，并制定相應(yīng)防控方案。本試驗(yàn)可為國(guó)內(nèi)無(wú)乳鏈球菌性乳房炎的針對(duì)性防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品類型 2019年7月于北方地區(qū)某大型奶牛場(chǎng)采集乳汁樣品240份、糞便樣品20份、墊料樣品30份、奶牛口腔樣品42份、奶牛乳頭末端樣品156份、奶襯內(nèi)壁樣品104份、擠奶員手臂樣品22份、洗手液和泡杯液樣品各15份。

乳汁樣品具體分為大罐奶樣品、泌乳前期(0～30 d，第1階段)、泌乳中期(60～180 d，第2階段)、泌乳后期(180 d以上，第3階段)、奶牛4個(gè)乳區(qū)混合奶樣、干奶前奶牛4個(gè)乳區(qū)混合奶樣、治愈隔離牛4個(gè)乳區(qū)混合奶樣、治療牛4個(gè)乳區(qū)混合奶樣和臨床型乳房炎患病乳區(qū)奶樣。各階段又分為前3把奶和奶樣。使用一次性采樣杯采集，擠奶時(shí)直接接取對(duì)應(yīng)樣品，左前、右前、左后、右后4個(gè)乳區(qū)分別接取5 mL左右奶樣，每份樣品約20 mL，搖勻并做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。

奶?？谇粯悠贩譃闊o(wú)乳鏈球菌性乳房炎治愈后隔離牛群(定義為A群)、無(wú)乳鏈球菌性乳房炎治療牛群(定義為B群)和非無(wú)乳鏈球菌性乳房炎治療牛群(定義為C群)。奶牛乳頭末端樣品依采集時(shí)間分為奶牛進(jìn)入擠奶廳后乳頭末端樣品(定義為a類)、前藥浴結(jié)束后乳頭末端樣品(定義為b類)和后藥浴開始前乳頭末端樣品(定義為c類)，依奶牛類型分為無(wú)乳鏈球菌性乳房炎治愈隔離牛樣品(即A群)、治療牛樣品(即BC群)、泌乳前期奶牛樣品、泌乳中期奶牛樣品和泌乳后期奶牛樣品。奶襯內(nèi)壁環(huán)境樣品依采集時(shí)間分為泡杯前樣品(定義為d類)和泡杯后樣品(定義為e類)，依奶牛類型分為治愈隔離牛樣品(即A群)和治療牛樣品(即BC群)。擠奶員手臂樣品(定義為f類)、泡杯液樣品(定義為g類)和洗手液樣品(定義為h類)均分為健康奶牛擠奶廳(即大奶廳)樣品和乳房炎治療牛擠奶廳(即小奶廳)樣品?？谇弧⒛膛Ｈ轭^末端皮膚、奶襯內(nèi)壁、擠奶員手臂(洗手后)均使用浸泡于滅菌生理鹽水的無(wú)菌棉簽進(jìn)行涂抹，在取樣部位涂抹3～5次，涂抹后的棉簽置于有少量滅菌生理鹽水的離心管中，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。洗手液、泡杯液是液態(tài)樣品，均使用一次性采樣杯采集，采集每個(gè)擠奶廳使用后的洗手液、泡杯液，每份樣品約50 mL，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。

糞便和墊料樣品分別來自臨床乳房炎治愈后隔離牛群(乳房炎治療后在隔離牛群中飼養(yǎng)30 d)和臨床乳房炎治療牛群。糞便樣品使用一次性自封袋采集，到對(duì)應(yīng)圈舍采集新鮮糞便，同一圈舍通過5點(diǎn)采樣法盡量選取不同位置樣品，保證樣品均勻性。每份樣品約20 g，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。墊料使用一次性自封袋采集，到對(duì)應(yīng)圈舍采集墊料，棄去表層較為干燥的墊料，采集深部潮濕墊料，每份樣品濕度均勻，同一圈舍選取不同臥床的墊料。每份樣品約20 g，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。墊料樣品使用前，取適量樣品于適量滅菌生理鹽水中搖勻，靜止30 min后取上層液體作為墊料浸出液(液態(tài)樣品)加以使用，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器 脫纖維綿羊血(TX0030-100 mL)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基(HB0312)、改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基(HB8706)，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；無(wú)乳鏈球菌特異性引物、溴化乙錠(A600195-0001)，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(AS221-01)，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；西班牙瓊脂糖Biowest agrose(111760)，購(gòu)自上?；鄯f生物科技有限公司。另有滅菌棉簽若干，一次性自封袋若干，一次性采樣杯若干，滅菌生理鹽水，ddH2O。立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S)，產(chǎn)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；旋渦混合器(HQ-60-II)，產(chǎn)自北京北方同正有限公司；電熱恒溫水槽(HWS12型)，產(chǎn)自上海一恒科技有限公司；梯度基因擴(kuò)增儀(Vetri 96)，產(chǎn)自美國(guó)ABI公司；臺(tái)式電子天平(BSA1245-CW)，產(chǎn)自德國(guó) Sartorius 公司；電泳儀(DYY-6D型)、凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B)，均產(chǎn)自北京六一儀器公司；生物安全柜(HR40-IIA2)，產(chǎn)自青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 無(wú)乳鏈球菌的分離與純化 初代培養(yǎng)使用5%綿羊血的BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。液態(tài)樣品(奶樣、墊料浸出液、泡杯液、洗手液)和糞便樣品用無(wú)菌棉簽劃線，各類拭子樣品可用采樣時(shí)的涂抹棉簽劃線，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。無(wú)乳鏈球菌在5%綿羊血BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為灰白色、不透明、針尖樣小菌落，菌落光滑凸起、濕潤(rùn)有光澤，呈α溶血或β溶血[7]。純化鑒定培養(yǎng)用5%綿羊血改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行，從初代培養(yǎng)皿中用接種環(huán)挑取無(wú)乳鏈球菌疑似菌落接種于純化鑒定培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。無(wú)乳鏈球菌在本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為淡紫(藍(lán))色、不透明、針尖狀小菌落，菌落光滑凸起、濕潤(rùn)有光澤[8]。

1.4 無(wú)乳鏈球菌的PCR鑒定 挑取純化培養(yǎng)基上的無(wú)乳鏈球菌疑似菌株，接種至裝有腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基的離心管中，放至37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)24 h，得到細(xì)菌懸液。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書對(duì)無(wú)乳鏈球菌疑似菌株懸濁液進(jìn)行DNA提取，獲取大片段、高純度、穩(wěn)定質(zhì)量的基因組DNA。提取出的無(wú)乳鏈球菌疑似菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)選擇50 μL體系：提取的DNA 5 μL，2×RapidTaqMasterMix 25 μL，ddH2O 15 μL，上游引物V1(5′-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3′)2.5 μL，下游引物V2(5′-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3′)2.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 為1個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；以上循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min[9]。擴(kuò)增好的無(wú)乳鏈球菌疑似菌株DNA通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，相同大小的DNA分子以相同速度向正極方向運(yùn)動(dòng)，電泳條帶與標(biāo)準(zhǔn)無(wú)乳鏈球菌菌株條帶一致的疑似菌可確認(rèn)為無(wú)乳鏈球菌。

2 結(jié)果

2.1 乳汁樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率 乳汁樣品中總檢出率為13.1%，檢出率最高的是大罐奶，11份樣品中7份都檢出了無(wú)乳鏈球菌，檢出率為63.6%，存在無(wú)乳鏈球菌全群感染。見表1。

表1 乳汁樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率

2.2 口腔樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率 口腔拭子整體檢出率較高，42份樣品中共檢出無(wú)乳鏈球菌11株，總檢出率為26.2%。見表2。

表2 口腔樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率

2.3 乳頭末端樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率 奶牛乳頭末端只有兩類樣品檢測(cè)出無(wú)乳鏈球菌，一是無(wú)乳鏈球菌治療牛，檢出率為40.0%；二是泌乳中期(60～180 d)奶牛，檢出率為16.7%。其他各類乳頭末端皮膚拭子樣品的無(wú)乳鏈球菌檢出率均為0。見表3。

表3 奶牛乳頭末端樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率

2.4 奶襯內(nèi)壁樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率 奶襯內(nèi)壁在擠奶前無(wú)乳鏈球菌檢出率為0，擠奶后無(wú)乳鏈球菌檢出率為20.0%(治療牛)和2.1%(泌乳牛)，說明無(wú)乳鏈球菌是在擠奶后乳汁掛在奶襯內(nèi)壁上的，且經(jīng)過泡杯液消毒后無(wú)乳鏈球菌被殺死。見表4。

2.5 其他樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率 其他位點(diǎn)樣品中，糞便樣品總檢出率為25.0%，健康牛奶廳擠奶員手臂上檢出率為16.7%，沼渣墊料、泡杯液、洗手液等位點(diǎn)沒有檢出無(wú)乳鏈球菌。見表5。

表5 其他樣品中無(wú)乳鏈球菌檢出率

3 討論

本試驗(yàn)中，大罐奶中無(wú)乳鏈球菌檢出率為63.6%，隔離牛無(wú)乳鏈球菌檢出率為28.0%，表明該奶牛場(chǎng)存在較為嚴(yán)重的全群感染，感染基數(shù)較大。從新產(chǎn)牛階段到干奶前，各階段無(wú)乳鏈球菌檢出率逐漸降低，到進(jìn)入干奶期之前降低至0，說明在泌乳前期無(wú)乳鏈球菌的感染率高，而泌乳后期的感染率逐漸下降。這可能與乳腺組織內(nèi)免疫細(xì)胞對(duì)乳房鏈球菌的清除能力有關(guān)[10]。由于分娩應(yīng)激及產(chǎn)后營(yíng)養(yǎng)代謝病等影響，奶牛的乳腺免疫力在泌乳早期通常低于泌乳后期[11]。從另一方面來說，奶牛在泌乳早期發(fā)生乳房炎，會(huì)帶來更大的經(jīng)濟(jì)損失，并導(dǎo)致奶牛的乳腺在以后的泌乳階段更容易被感染[12]。因此，泌乳前期奶牛無(wú)乳鏈球菌較高的感染率提示，本牛場(chǎng)中需要更為重視干奶期和分娩前后奶牛的健康管理。

目前無(wú)乳鏈球菌的主要傳播途徑是接觸性傳播，即在奶廳內(nèi)通過奶襯、擠奶員的手臂或毛巾等，由患病奶牛傳染至健康奶牛的乳區(qū)[13]。近年來，也有研究證明，無(wú)乳鏈球菌可以通過糞便和墊料等途徑侵入乳房[5-6]。在本試驗(yàn)中，糞便和奶?？谇恢锌蓹z測(cè)出無(wú)乳鏈球菌，推測(cè)可能是飼料和飲水中存在無(wú)乳鏈球菌，并經(jīng)采食和飲水進(jìn)入口腔并生長(zhǎng)繁殖，形成糞—口途徑，這與Jorgensen等的研究結(jié)論一致[5]。然而，在本試驗(yàn)中，沼渣墊料中沒有檢測(cè)出無(wú)乳鏈球菌，說明沼渣墊料可能不適于無(wú)乳鏈球菌在體外的生長(zhǎng)繁殖，但也不排除檢測(cè)方法存在一定局限性。此外，該奶牛場(chǎng)新產(chǎn)牛墊料成分為沼渣和稻殼粉的混合物，在新產(chǎn)牛階段較高的檢出率可能與稻殼粉的摻入有關(guān)。

在本試驗(yàn)中，無(wú)乳鏈球菌在奶牛乳頭末端皮膚檢出率較低，僅出現(xiàn)在進(jìn)廳后的乳頭皮膚上，說明牛舍環(huán)境中存在無(wú)乳鏈球菌，可能與乳頭末端受到糞便污染有關(guān)。因此我們推測(cè)，在該奶牛場(chǎng)中，存在口—糞—乳房的感染途徑。消毒后乳頭末端檢出率為0，表明擠奶前的消毒操作有效且有必要。然而脫杯后藥浴前的乳頭末端未發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌，可能與檢測(cè)數(shù)量較少有關(guān)，也可能由于乳頭末端取樣量較少導(dǎo)致。此外，泡杯前的奶襯內(nèi)壁可檢出無(wú)乳鏈球菌，可能是乳頭末端皮膚表面的細(xì)菌沾到內(nèi)襯上，也有可能是乳腺深部的細(xì)菌沾到內(nèi)襯上。乳房炎奶廳中擠奶機(jī)奶襯的無(wú)乳鏈球菌檢出率為20.0%，有可能在患病牛奶廳中，奶襯是一條重要的傳播途徑；健康牛奶廳奶襯無(wú)乳鏈球菌檢出率為2.0%，在健康牛奶廳奶襯可能并非重要傳播途徑。健康牛奶廳擠奶員手臂拭子無(wú)乳鏈球菌檢出率為16.7%，這說明消毒洗手液殺菌效力或洗手操作方式可能存在問題。由于擠奶員接觸牛只很多，如果不能保證對(duì)手臂進(jìn)行有效消毒，那么擠奶員的手臂很有可能成為無(wú)乳鏈球菌的重要傳播途徑[14]。

通過以上分析，該奶牛場(chǎng)主要存在的無(wú)乳鏈球菌傳播途徑有兩條：一是擠奶廳內(nèi)的接觸傳播。擠奶廳是牛群密度最大、牛只工作強(qiáng)度最大且所有牛只都要接觸的場(chǎng)所，也是引起乳房炎發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)所[15]。該奶牛場(chǎng)擠奶廳無(wú)乳鏈球菌檢出率最高的位點(diǎn)是擠奶員手臂，由于擠奶員持續(xù)接觸牛群，如果沒做好洗手消毒很有可能將無(wú)乳鏈球菌從感染牛只攜帶至健康牛只，造成更大面積的傳播。其次，通過檢出結(jié)果分析可發(fā)現(xiàn)，藥浴可有效減少乳頭末端無(wú)乳鏈球菌檢出率、泡杯可有效減少奶襯內(nèi)壁無(wú)乳鏈球菌檢出率，證明藥浴和泡杯操作對(duì)切斷傳播途徑起著重要作用。二是口—糞—乳房傳播。牛只通過采食和飲水將飼料、飲水中積存的無(wú)乳鏈球菌攝入，給無(wú)乳鏈球菌提供口腔這一繁殖環(huán)境，并通過排便將無(wú)乳鏈球菌散播到環(huán)境中，最終無(wú)乳鏈球菌通過糞便等環(huán)境侵入乳房，造成感染[5]。此外，治愈隔離牛群乳房中仍存在無(wú)乳鏈球菌，可能是因?yàn)榭股刂委煵⑽催_(dá)到細(xì)菌學(xué)治愈效果，需要進(jìn)一步評(píng)估抗生素治療方案[16]。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，奶牛場(chǎng)應(yīng)制定一種綜合性管控方案。首先，對(duì)牛群進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)，及時(shí)將感染牛只隔離分群，且保證隔離群和非隔離群不共用擠奶廳。其次，鑒于擠奶廳的重要性，提高工作人員的操作意識(shí)，如奶杯泡杯操作、乳頭末端藥浴操作和擠奶員自身手臂清潔操作，切斷奶廳中接觸性傳播途徑。最后，加強(qiáng)隔離群奶牛的飼養(yǎng)管理，提高牛舍清潔度，如清糞頻率、臥床維護(hù)和墊料消毒，切斷口—糞—乳房傳播途徑。