高鑫鑫，王艷文，郭 晶，趙聰慧，王文婷，劉文強，李旭勇

(聊城大學農(nóng)學院，山東 聊城 252000)

A型流感病毒是一種RNA病毒，根據(jù)病毒表面的血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramidinase，NA)分為不同的亞型(H1～H18和N1～N11)。除了在蝙蝠中分離的H17N10和H18N11亞型流感病毒[1-2]，在禽類可檢測到所有亞型流感病毒(H1～H16和N1～N9)。流感病毒不僅能感染雞、鴨等禽類，還能夠感染人。H1N1、H2N2和H3N2亞型流感病毒可在人類傳播，在歷史上引起了數(shù)次大流行[3]。H5N1、H5N6、H7N9和H9N2等亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)能夠直接從動物感染人類，表明這些亞型的病毒可能具有通過進一步進化而成為引起新的大流行病的潛在威脅[4-6]。1966年，首次在家禽中發(fā)現(xiàn)H9N2亞型流感病毒[7]。研究表明，H9N2 AIV能夠為感染人類的H5N1、H5N6、H7N9 和H10N8等亞型AIV提供內部基因[8-12]。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H9N2同H4N6 AIV共感染家禽后在宿主體內會發(fā)生高頻率的基因重組，并產(chǎn)生比野生型病毒具有更高毒力的子代重組病毒[13]。

為更深入了解H9N2 AIV遺傳演化規(guī)律，本試驗于2017—2019年在活禽市場采集樣品，分離選取3株 H9N2 AIV進行全基因組序列測定、遺傳進化及關鍵氨基酸位點分析，總結了數(shù)據(jù)庫中歷年H9N2分離株HA基因關鍵氨基酸位點的變異規(guī)律，為進一步了解H9N2 AIV的進化、變異規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及雞胚 試驗中所用的3株H9N2分離株A/chicken/Weifang/862/2017(簡稱CK/862/17)來源于濰坊某養(yǎng)殖場病雞組織、毒株A/chicken/Liaocheng/844/2018(簡稱CK/844/18)和毒株A/pigeon/Liaocheng/168/2019(簡稱PG/168/19)均來源于山東省農(nóng)貿市場，由本實驗室分離鑒定并保存。其中CK/862/17和CK/844/18宿主為雞，PG/168/19來源于鴿子。SPF雞胚，購自濟南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒(TIANamp Virus RNA Kit,DP315-R)，購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和PCR混合劑(Quick Taq?HS DyeMix)，均購自TOYOBO科技有限公司；分子量Marker，購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購自OMEGA公司；測序反應由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 病毒的分離 采集山東活禽市場售賣家禽的泄殖腔和咽喉拭子；取發(fā)病雞氣管、喉頭、肺組織置于前期加入雙抗的PBS緩沖液中，以60 Hz的頻率研磨2 min。然后以8 000 r/min的轉速離心5 min，取上清液0.25 mL接種于10日齡的雞胚中，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收取雞胚尿囊液，分裝并置于-80 ℃保存。

1.4 RT-PCR 鑒定及序列測定 取尿囊液提取其RNA，并反轉錄成cDNA。利用禽流感病毒HA的鑒定引物對其亞型進行鑒定。接著利用H9N2亞型病毒各基因節(jié)段測序引物以50 μL的體系進行PCR擴增，50 μL體系：cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Mix 25 μL,H2O 21 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s；退火溫度58 ℃，退火時間30 s，68 ℃ 延伸1 min 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并將膠塊置于凝膠成像儀下觀察，將特異性條帶膠回收純化后送至測序公司利用測序引物進行病毒的全基因序列測定。

1.5 遺傳演化分析 將各基因節(jié)段測序結果導出后利用DNASTAR 7.1中的MegAlign程序對8個基因片段序列拼接，應用NCBI中BLAST檢索相似性序列以及代表性毒株序列，利用MEGA 7.0軟件對各基因節(jié)段的序列進行同源性及關鍵位點的分析，并利用Neighbor-joining 法繪制下載序列與分離毒株序列8個基因片段的遺傳進化樹。

2 結果

2.1 全基因組序列的測定

2.1.1 核苷酸同源性分析 從2017—2019年分離的H9N2 AIV中，根據(jù)分離年份、地區(qū)和宿主，選出3株 分離株CK/862/17、CK/844/18和PG/168/19進行全基因組序列的測定，在NCBI中BLAST上比對分析，繪制8個基因節(jié)段遺傳進化樹。結果顯示，CK/862/17和CK/844/18的8個基因節(jié)段與近幾年流行的H9N2病毒高度同源；PG/168/19的8個基因節(jié)段來源復雜，PB2和PB1與H7N9同源性較高，其中PB2與A/Chicken/Anhui/AH395/2017(H7N9)(GenBank 登錄號MG575543.1)同源性為98.38%，PB1與A/Changsha/26/2017(H7N9)(GenBank 登錄號MF370244.1)同源性為98.90%(表1)。

表1 與分離株各基因片段的核苷酸同源性最高的病毒株

2.1.2 分離株與疫苗株HA、NA基因同源性分析 3株分離株與當前市場上的疫苗株進行HA、NA基因序列比對分析表明，與LG1株的同源性最高，HA基因序列的同源性為94.1%～95.1%，NA基因序列的同源性為93.9%～95.3%，但分離株與其他疫苗株的同源性較低(表2)。另外近年來，H9N2亞型AIV經(jīng)常在已免疫過疫苗的雞群中分離出[14],說明目前流行的H9N2病毒與早期H9N2疫苗毒株相比已發(fā)生抗原的改變，致使現(xiàn)有的疫苗保護效力降低或者失效。這就需要企業(yè)生產(chǎn)疫苗與流行毒株的抗原性相匹配。

表2 3 株分離株與疫苗株 HA、NA基因的同源性比較

2.2HA基因的分子特征、同源性和遺傳分析

2.2.1HA基因序列的進化分析 3株H9N2分離株與參考毒株的HA基因序列進行遺傳進化分析，繪制基因進化樹(封三彩版圖1A)。HA基因的遺傳進化分為歐亞種系和北美種系，3株分離株的遺傳距離較近，均屬于歐亞分支的Y280亞群。3株分離株HA基因的核苷酸同源性為95.6%～98.0%。

2.2.2 HA蛋白關鍵氨基酸位點分析 HA蛋白裂解位點的氨基酸組成均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的特征。與早前分離的經(jīng)典毒株相比，3株分離株的受體結合位點在第101、138、153、155、194、195位和第228位相對保守，第183位突變?yōu)镹，第190 位突變?yōu)門。左側壁(第240～245位)的氨基酸組成形式均為NGLMGR，右側壁(第138～142位)為GTSTA。3株分離株第226位受體結合位點均為L，具有與哺乳動物α,2-6唾液酸受體結合的特征(表3)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載2019年之前所分離的H9N2流感病毒的HA蛋白氨基酸序列，對其第183、190位和第226位氨基酸殘基位點分析表明：H9N2流感病毒的受體結合位點顯現(xiàn)多樣性，其中H9N2 AIV的HA蛋白第226位氨基酸主要以Q和L為主，但也出現(xiàn)了一些Q和L 之外的氨基酸，如M、F等新的氨基酸。從整體趨勢上來看，H9N2亞型流感病毒HA蛋白的第183位點由早年的H逐漸向N轉化，第109位點主要比例由A向T轉化，第226位氨基酸由早年的Q突變?yōu)長，普遍具有了與哺乳動物α,2-6唾液酸受體結合的特征(封三彩版圖2A～2C)。

表3 分離株HA蛋白的氨基酸序列分析

對3株分離株HA蛋白潛在糖基化位點分析表明(表4)，HA1蛋白上具有6個共同的潛在糖基化位點，分別為第21、74、133、290、297位和第305位。HA2蛋白上具有1個共同的潛在糖基化位點，為第484位，其中分離株CK/844/18在第543位由NGS突變?yōu)镹GR，造成了1個糖基化位點的缺失。3株分離株HA蛋白的第202～204位氨基酸由NRT突變?yōu)镹RI，造成1個糖基化位點的缺失；第295～298位由NCP突變?yōu)镹CS，新增1個糖基化位點，這與數(shù)據(jù)庫中分離株的變化趨勢一致(封三彩版圖2D)。

表4 分離株HA蛋白的潛在糖基化位點分析

2.3NA基因的分子特征和遺傳分析 同HA基因的遺傳進化樹相類似，NA基因的遺傳進化樹也分為歐亞種系和北美種系。3株分離株NA基因均屬于歐亞分支的Y280亞群，核苷酸同源性為97.3%～97.6%(封三彩版圖1B)。3株分離株共有的NA蛋白中有6個糖基化位點，分別為第44、69、86、146、200位和第234位。分離株CK/862/17在第404位由S突變?yōu)锳，造成1個潛在糖基化位點的缺失。3株NA蛋白的第256位氨基酸由S突變?yōu)镽，導致第256位糖基化位點的缺失(表5)。3株分離株的耐藥性相關基因位點未發(fā)生突變，第274位仍為S，第294位仍為N。

表5 分離株NA蛋白的潛在糖基化位點分析

2.4 分離株內部基因遺傳進化分析 3株分離株的內部基因的同源性依次為M94.2%～97.8%、NP97.3%～98.7%、NS97.4%～98.3%、PA96.3%～96.9%、PB1 94.8%～97.6%、PB2 96.4%～96.8%。分離株CK/844/18與CK/862/17各基因片段的同源性略高于PG/168/19。3 株分離株的內部基因呈現(xiàn)多樣性的特點，PB1、PA、NP來自F98亞系(圖3B～3D)；M基因來自G1亞系。分離株的PB2、NS基因與參照標準流感病毒毒株的遺傳進化關系比較 遠，形成單獨的Unknown Avian分支。3株分離株的PB2蛋白的第340位和第627位存在差異，CK/862/17與PG/168/19的第340位為K，CK/844/18的第340位為R；CK/844/18與CK/862/17的第627位為E，PG/168/19的第627位為V；第588位均為V，第701位均為D；3株分離株的NS 蛋白中第114、124位和第212位氨基酸分別為S、V、P。第588位的突變使病毒在哺乳動物宿主體內的復制、致病及傳播能力增強，NS基因中第114、124位和第212位的突變使干擾素刺激基因(ISGs)mRNA 的轉錄活性受到抑制。

圖3 3株H9N2 AIV的 PB2(A)、PB1(B)、PA(C)、NP(D)、M(E)和NS(F)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

H9N2病毒為低致病性AIV，家禽感染H9N2后，生產(chǎn)性能和免疫力降低，易引起繼發(fā)性細菌感染導致較高的死淘率，嚴重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。H9N2病毒的內部基因易與其他亞型發(fā)生基因重組，形成一些高致病力的新型流感病毒。

本試驗3株分離株HA蛋白的第226位點均為L，能夠與哺乳動物α,2-6唾液酸受體結合，這與早前分離的H9N2亞型禽流感的特征一致[14]，促使人感染的可能性急劇增加。同時3株分離株HA蛋白在第295～298位氨基酸由NCP突變?yōu)镹CS，新增了1個糖基化位點，其可能與病毒感染宿主和宿主免疫反應抗原遞呈有關[15]，相關機制仍有待于進一步研究。PB2蛋白差異性較大，其中T271A、R340K、A588V、E627K、D701N等特異性位點的突變能夠使病毒在哺乳動物宿主體內的復制、致病及傳播能力增強[16-17]。NS蛋白中P114S、M124V、S212P氨基酸突變與H9N2亞型AIV拮抗宿主先天性免疫應答密切相關，它能夠顯著抑制干擾素刺激基因(ISGs)mRNA的轉錄活性[18]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，G1-like的PB2和M基因在出現(xiàn)新基因型方面具有重要意義[19-20]。H9N2亞型AIV在我國流行廣泛，致病性和感染哺乳動物的能力逐漸增強，對我國公共衛(wèi)生安全造成的潛在危險也在逐漸增強，此研究從基因水平為探索H9N2 流感病毒的遺傳進化規(guī)律及防控提供科學依據(jù)。