王超，音金萍，卓少元

（廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧530200）

肝臟是人體最主要的藥物代謝器官。在藥物使用過程中，因藥物本身或/及其代謝產物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟損傷稱為藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）。據臨床病例統(tǒng)計分析結果顯示［1-2］，中草藥是導致DILI的重要原因之一。健脾益氣方是本課題組根據肝癌臨床和相關文獻研究歸納總結出的基本方，主要對應臨床肝癌脾氣虛弱的基本證型；前期研究發(fā)現該方不僅可以延長DEN（二乙基亞硝胺）肝癌大鼠生存率、降低肝細胞炎性壞死和肝癌組織癌基因表達的作用［3-4］，而且能夠通過調控肝癌炎癥微環(huán)境抑制肝癌細胞增殖、侵襲，促進肝癌細胞凋亡［5-7］。但是健脾益氣方在治療肝癌過程中對正常肝臟是否有保護作用尚不明確。

網絡藥理學基于系統(tǒng)生物學的理論進行綜合網絡分析，已廣泛應用于中藥的機制研究［8-10］。因此本研究采用網絡藥理學以及分子對接技術分析健脾益氣方通過抗炎和免疫調節(jié)防治急性肝損傷（ALI）的潛在靶標，并利用D-GalN所致的ALI模型，觀察健脾益氣方干預對ALI大鼠肝組織形態(tài)、損傷指數、Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體活化通路等的影響，探討其保肝的可能性，以期為該方的臨床應用提供基礎實驗支持。

1 材料

1.1 數據庫及軟件網絡藥理學以及分子對接涉及的主要數據庫及軟件有TCMSP（https：//www.tcmsp-e.com/）、PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swis?stargetprediction.ch/）、Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、String數據庫（https：//www.string-db.org/）、PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）和Cytoscape3.8.2軟件、Autodock 4.2軟件、Pymol 2.5軟件。

1.2 動物SPF級SD大鼠30只，雄性，8周齡，體質量（200±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016-0002，生產許可證號：SYXK（湘）2014-0012，質量合格證號：43004700040620，動物倫理審查證書編號：DW20210328-049。采取標準飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.3 藥物及試劑健脾益氣方由七味中藥組成（黃芪30 g、白術10 g、薏苡仁15 g、白芍15 g、神曲10 g、茯苓15 g、法半夏10 g），購于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。健脾益氣方按處方稱量藥材，加10倍量蒸餾水浸泡1 h，第一次煎煮1.5 h，再次加入8倍量蒸餾水煎煮1 h，合并兩次濾液，濃縮配制成1 g/ml的藥液，過濾除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆?。D-GalN（純度>99%，美國Sig?ma-Aldrich公司，批號#SLBT9951）；ALT和AST測定試劑盒（長春匯力生物技術有限公司，批號分別為20181010、20181012）；GGT測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20181013）；大鼠IL-1β、IL-18和NF-κB酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為T19018385、6S5915PQSP、QKZAQ7RBK1）；大鼠Caspase-1活性測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20190314）；ASC單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotecnology公司，批號#J1518）；β-Actin抗體（北京博奧森生物，批號A108282882）；NLRP3抗體（英國Abcam公司，批號B-3）；山羊抗兔的二抗和山羊抗鼠的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為00081002、00062578）。

1.4 儀器Epoch Biotek全波長酶標儀（美國Biotek公司）；Chemray全自動生化分析儀（美國Rayto公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）；ST 16R高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司）；電泳儀和全能型成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 健脾益氣方治療急性肝損傷潛在靶點網絡模型構建通過TCMSP數據庫以及文獻檢索，收集到健脾益氣方中黃芪、白芍、白術、薏苡仁、半夏、茯苓的有效成分。TCMSP數據庫未收錄神曲的有效成分，故通過查閱文獻獲?。?1-12］。利用口服利用度OB≥30%和藥物相似性DL≥0.18為條件篩選以上7味中藥的有效成分。將篩選到的有效成分在PubChem數據庫中找到對應的SMILES編號，利用Swiss Target Prediction對有效成分的靶點進行預測，得到健脾益氣方活性成分的靶點。通過在Gene Cards數據庫和OMIM數據庫中分別檢索“acute liver injury，inflammation，immunoregula?tion”，將急性肝損傷、炎癥和免疫調節(jié)三者的靶點取交集并用Uniprot ID進行標準化得到疾病靶點。將疾病靶點和健脾益氣方活性成分靶點取交集去重得到健脾益氣方通過抗炎和免疫調節(jié)防治ALI的潛在靶點。用Cytoscape 3.8.2軟件構建健脾益氣方-活性成分-疾病靶點相互作用網絡。利用String數據庫構建靶點蛋白質相互作用網絡圖，用Cytoscape 3.8.2進行可視化分析。

2.2 主要活性成分與靶點分子對接在TCMSP數據庫中下載活性成分結構的mol2格式文件，在PDB數據庫中檢索靶點分子的PDB格式文件，用Pymol軟件去除配體。用Autodock 4.2軟件進行分子對接，將對接結果用Pymol軟件可視化并輸出。

2.3 動物分組、模型復制與給藥將SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為5組：正常組、模型組和健脾益氣方低、中、高劑量組（JP-L組、JP-M組、JP-H組），每組6只。其中，模型組和JP-L組、JP-M組、JP-H組大鼠均按600 mg/kg一次性腹腔注射D-GalN復制ALI模型；正常組大鼠按600 mg/kg一次性腹腔注射生理鹽水。造模后JP-L組、JP-M組、JP-H組分別按成人用藥量的3、6、12倍立即給予健脾益氣方灌胃，即5.25 g/kg、10.5 g/kg、21 g/kg（將成人每日口服生藥量折算成大鼠等效劑量作為中劑量組用量：大鼠中劑量用藥=成人每日口服生藥量÷60 kg×6=10.5 g/kg［13］），每日2次，連續(xù)給藥2 d。正常組和模型組大鼠以10.5 g/kg的生理鹽水灌胃。各組大鼠均于末次給藥后1 h內用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動脈取血分離血清，取完整肝臟組織。

2.4 肝臟組織形態(tài)學觀察取肝臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組肝臟組織病理學變化。

2.5 血清生化指標與炎癥因子含量檢測采用生化法檢測大鼠血清中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）和γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）的含量；采用ELISA檢測血清中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）和核因子κB（NF-κB）的含量。以上步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.6 肝臟組織NLRP3和凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）的蛋白表達水平的檢測用WB法檢測肝臟組織中NLRP3和ASC蛋白表達水平。取肝臟組織20 mg，加入裂解液冰上裂解、提取蛋白，按BCA法測定蛋白含量。經SDS-PAGE電泳后冰浴轉膜，TBST洗滌3次，封閉液封閉1.5 h，加入一抗4℃孵育過夜（稀釋倍數β-Actin為1∶1 000，ASC為1∶400，NLRP3為1∶1 000），洗滌同上，加入二抗室溫孵育1 h（稀釋倍數為1∶3 000），采用ECL化學發(fā)光法顯色，用全能型成像分析系統(tǒng)采集照片。

2.7 肝組織中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）活性檢測取肝臟組織加裂解液冰上裂解提取總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度到1 mg/ml。按照Caspase-1活性測定試劑盒說明書進行操作。

2.8 數據統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數據采用單因素方差分析（one-way ANO?VA），非正態(tài)分布的數據則采用Mann-Whitney U秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 健脾益氣方治療ALI的潛在靶點分析通過網絡藥理學分析，篩選得到79個健脾益氣方的活性成分，預測到834個活性成分的靶點。通過Gene Cards與OMIM數據庫檢索到與急性肝損傷、炎癥以及免疫調節(jié)相關的基因靶點取交集去重后有107個，與健脾益氣方活性成分預測的834個靶點取交集后得到39個健脾益氣方治療ALI的潛在靶點。將中藥、活性成分、靶點構建可視化網絡圖，結果見圖1。健脾益氣方有68個活性成分直接參與到網絡圖中。將39個潛在靶點進行PPI網絡拓撲分析（圖2），涉及33個節(jié)點，151條邊。節(jié)點表示基因，大小表示degree值；邊表示基因間的作用關系，粗細表示Combine score大小。這些基因的分子功能主要有磷酸酶結合、細胞因子受體結合、轉錄因子活性等；涉及的KEGG代謝通路主要有乙肝病毒相關、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等。主要涉及MAPK、IL-6/STAT3、NLRP3/IL-1β等多條信號通路。結合前期研究結果本研究主要圍繞NLRP3/IL-1β通路相關分子（如NLRP3、IL-1β、RELA/NF-κB p65）進行分子對接和動物實驗驗證，在圖2中以黃色圓圈所示。

圖1 健脾益氣方治療急性肝損傷的“藥物-成分-潛在靶點”網絡

圖2 健脾益氣方通過抗炎和免疫調節(jié)治療急性肝損傷的潛在靶點的PPI網絡

3.2主要活性成分與靶點分子對接選擇在“藥物-成分-潛在靶點”網絡中degree值較高的3個活性成分與NLRP3、IL-1β、RELA進行分子對接。對接的最低自由能越低，提示蛋白與配體之間結合活性越好。分子對接結果顯示，選取的3個活性成分與NLRP3、IL-1β、RELA均能夠有效結合，結合的最低自由能均小于-5（表1）。將每個蛋白與配體結合有最低結合能的對接結果進行可視化處理，見圖3。

表1 主要活性成分與靶點分子對接結合能

圖3 主要活性成分與靶點的對接模式圖

3.3 健脾益氣方對ALI大鼠肝組織形態(tài)學的影響肉眼觀察及HE染色結果（見圖4）可見：正常組大鼠肝臟顏色鮮紅、邊緣扁尖銳利、質地柔軟、表面光滑無任何異常；肝小葉的結構規(guī)則，肝細胞排列成條索狀，以中央靜脈為中心向四周放射。模型組大鼠肝臟色澤晦暗伴有粘連，部分位置有出血，可見白色小點或白色壞死病灶，部分大鼠肝臟變大；肝小葉結構破壞明顯，肝血竇充血，肝細胞多處成點狀壞死，肝細胞核消失，壞死灶內有大量炎細胞浸潤。健脾益氣方治療后，低劑量組大鼠除肝血竇充血減少外，其它與模型組相似；中劑量組大鼠肝臟形態(tài)基本正常，色澤較紅，質地較柔軟，無明顯病變；高劑量組大鼠肝臟體積稍大，個別表面呈細小顆粒狀，無出血現象。健脾益氣方中、高劑量組大鼠肝細胞損傷及炎細胞浸潤程度較輕。

圖4 肝臟一般情況及組織病理學比較（HE×400）

3.4 健脾益氣方對ALI大鼠血清生化指標含量的影響見表2。與正常組相比，模型組ALT、AST和GGT的含量均升高，其中ALT和AST的組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。經健脾益氣方治療后，ALI大鼠血清中ALT、AST和GGT的含量均出現降低趨勢，且隨劑量的增加而含量逐漸降低。其中健脾益氣方中、高劑量組的ALT、AST、GGT與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；低劑量組的ALT與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 健脾益氣方對ALI大鼠血清ALT、AST和GGT含量的影響 （±s）

表2 健脾益氣方對ALI大鼠血清ALT、AST和GGT含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01

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3.5 健脾益氣方對ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響見表3。與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均升高；其中，IL-1β和NF-κB差異顯著（P<0.01）。經健脾益氣方治療后，ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB的含量均出現降低趨勢，且隨劑量的增加而含量逐漸降低；除低劑量組的IL-1β外，其它各治療組血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 健脾益氣方對ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響 （±s）

表3 健脾益氣方對ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01

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3.6 健脾益氣方對ALI大鼠肝組織NLRP3、ASC蛋白表達水平的影響WB法檢測各組大鼠肝臟組織中NLRP3、ASC蛋白含量，結果見圖5。與正常組比較，模型組大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，健脾益氣方各治療組大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），其中以中、高劑量組的效果最明顯。

圖5 健脾益氣方對ALI大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達的影響

3.7健脾益氣方對ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響見表4。模型組大鼠肝組織Caspase-1酶活性明顯升高，是正常組的179.75倍。健脾益氣方治療后，低、中、高劑量組的Caspase-1酶活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 健脾益氣方對ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響（±s）

表4 健脾益氣方對ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響（±s）

注：與模型組比較，①P<0.05，②P<0.01

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4 討論

合適的肝損傷動物模型是篩選與評價保肝藥物的關鍵。在眾多的肝損傷模型中，D-GalN誘導的急性肝損傷被認為是保肝新藥篩選與評價較理想的模型之一，但其合適的造模劑量存在一定的爭議［14-16］，根據以往研究結果，本研究選用600 mg/kg體重一次性腹腔注射D-GalN制備ALI模型。D-GalN與肝細胞內的UDP結合，耗竭UTP，使肝細胞內RNA、蛋白質合成受阻，糖和磷脂代謝發(fā)生障礙，從而導致肝細胞膜受損，引起肝細胞壞死，進而使ALT、AST、GGT等酶入血，因此，血清中ALT、AST、GGT可以反映肝損傷程度。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST、GGT含量均升高，并且ALT、AST差異顯著，結果顯示本研究成功復制了大鼠ALI模型。

健脾益氣方由七味中藥組成，以黃芪為君，白術、茯苓為臣，白芍、半夏、薏苡仁、神曲為佐，有補益正氣、健脾祛濕、散結消痞之功效。本研究結果顯示，健脾益氣方中、高劑量治療組均能改善急性肝損傷大鼠肝組織的病理變化，降低血清中ALT、AST、GGT含量（P<0.05或P<0.01），具有一定的保肝作用。

網絡藥理學基于系統(tǒng)生物學的方法被提出并迅速發(fā)展，從整體和網絡角度描述藥物、生物系統(tǒng)和疾病之間的關系，對現代中醫(yī)藥尤其是復方的研發(fā)提供了科學依據［8-10］。本研究通過網絡藥理學的方法篩選得到健脾益氣方通過抗炎和免疫調節(jié)治療急性肝損傷的活性成分68個，潛在靶標39個，這些潛在靶標涉及到多個生物學過程、多種分子功能和KEGG代謝通路，提示健脾益氣方防治急性肝損傷是多途徑、多靶點的干預機制。根據網絡藥理學的分析結果，本研究選取degree最高的前3個活性成分與得分較高的NLRP3炎性小體相關蛋白NLRP3、ILIB、RELA進行分子對接，結果顯示這3個成分與3個靶標蛋白均有較高的結合活性，驗證了網絡藥理學的結果。

NLRP3炎性小體（inflammasome）是由多種蛋白組成的復合物，主要由感受器蛋白NLRP3、銜接分子ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）及效應分子pro-caspase-1組成。多種刺激信號均可觸發(fā)NLRP3的激活，NLRP3招募并裂解procaspase-1；激活的Caspase-1可將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18，使之分泌到細胞外發(fā)揮各種炎癥效應［17］。NF-κB在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起到關鍵性作用，能夠誘導NLRP3炎性小體的活化［18］，且活化后的IL-1β還能利用其受體IL-1R1激活NF-κB［19］，從而形成“瀑布效應”加重細胞炎癥反應。本研究結果表明，模型組大鼠血清IL-1β、NF-κB含量，肝組織NLRP3和ASC蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），Caspase-1酶活性也明顯升高，進一步提示模型大鼠肝功能受損及NLRP3炎性小體的激活。本研究結果還顯示中、高劑量的健脾益氣方能夠明顯降低模型大鼠血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量，肝組織NLRP3和ASC蛋白表達水平，及肝組織Caspase-1酶活性（P<0.01）。提示健脾益氣方可能通過下調NLRP3炎性小體的活化從而抑制D-GalN致ALI大鼠中的炎癥反應，從而起到保肝作用。動物實驗結果與網絡藥理學以及分子對接分析的結果一致。

綜上所述，健脾益氣方對D-GalN致急性肝損傷大鼠具有明顯的保護作用，其中以中、高劑量的健脾益氣方防治的效果為佳。該方可明顯降低血清GGT、ALT、AST含量，及肝臟組織損傷指數，其作用機制可能與下調NLRP3炎癥小體的活化有關，但具體分子調控機制有待深入研究。