楊駿杰 趙世天 趙永見 孫悅禮 程韶 陶渝仁 趙東峰 盧盛 施杞,4 王擁軍,4 舒冰,4*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海市中醫(yī)藥研究院脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部重點實驗室(筋骨理論與治法)，上海 200032 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

骨質(zhì)疏松癥 (osteoporosis, OP)是以骨量降低和骨組織微細結(jié)構(gòu)退變、破壞而導(dǎo)致骨脆性增加、骨強度降低，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松性骨折 (osteoporotic fracture, OPF) 是OP最為嚴重的并發(fā)癥，患者內(nèi)固定治療穩(wěn)定性差，常伴隨骨重建異常，導(dǎo)致骨折的愈合緩慢；OPF患者以中老年人為主，常合并其他疾病，更易引起并發(fā)癥[2]。因此，相較于一般性骨折，OPF具有更高的致殘率和死亡率。2013年國際骨質(zhì)疏松基金會發(fā)現(xiàn)，全球每分鐘就有20例骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生。2050 年我國預(yù)計將有599萬例OPF發(fā)生，醫(yī)療衛(wèi)生支出將超過 254 億美金，給我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[4]。

除手術(shù)治療外，目前OPF的藥物干預(yù)主要針對的是其病理基礎(chǔ)，即骨質(zhì)疏松狀態(tài)，如雙膦酸鹽類、雌激素和降鈣素及活性維生素D類等[5]，且具有局限性，而針對骨折愈合過程的藥物卻較為少見。因此，臨床上迫切需要開發(fā)能夠促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合，從而縮短療程，減少并發(fā)癥的有效藥物。

施杞教授發(fā)揚石氏傷科的學(xué)術(shù)思想[6]，對待因傷致病，強調(diào)“氣血為先”，注重“臟腑為本”，在對中老年患者血瘀腎虛型骨折的臨床治療中總結(jié)形成了化瘀補腎基礎(chǔ)方(丹參12 g、女貞子9 g、墨旱蓮9 g、淫羊藿9 g、骨碎補9 g、獨活9 g)。本研究利用小鼠雙側(cè)卵巢切除復(fù)合左脛骨中段骨折模型，對化瘀補腎方在骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中的作用進行了研究，從而為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松性骨折的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3月齡雌性C57BL/6小鼠48只，由上海靈暢生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實驗動物部(動物福利審議批件號：LHERAW-19014)。室溫20～28 ℃，相對濕度40 %～70 %，自由進食飲水，12 h間隔照明。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、化瘀補腎方組，每組16只。

1.2 藥物、試劑與器材

化瘀補腎方(丹參12 g、女貞子9 g、墨旱蓮9 g、淫羊藿9 g、骨碎補9 g、獨活9 g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑中心提供。

血清雌二醇檢測試劑盒(ab108667，艾博抗上海貿(mào)易有限公司)，阿爾辛藍染液(A5268-25 G，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)，橙黃G染液(03756-25 G，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)，Micro-CT(CT80, 瑞士Bassersdorf公司)，異氟烷(R510-22，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，麻醉機(Matrx 07149，美國MIDMARK公司)，Electro Force測試儀(3200 Series III，美國Tainstrument公司)。

1.3 模型建立

模型組和化瘀補腎方組小鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)。小鼠麻醉后取俯臥位，備皮消毒，沿脊柱由髂后上嵴向上作一1 cm縱行切口，結(jié)扎卵巢周圍輸卵管，切除菜花狀卵巢?；丶{組織后逐層縫合。假手術(shù)組小鼠不切除卵巢，僅切除卵巢周圍部分脂肪。

OVX術(shù)后12周，各組小鼠均建立左側(cè)脛骨中段骨折模型。小鼠麻醉并左后肢備皮后，于外側(cè)前緣作一1 cm縱行切口，將 1 mL注射器針頭從脛骨平臺前外側(cè)沿脛骨長軸刺入脛骨約 1.5 cm后剪斷針頭，鋸斷脛骨中段，進行髓內(nèi)固定，縫合皮膚。

1.4 藥物干預(yù)

按 Meeh-Rubner氏公式計算人表面積為1.8 m2，小鼠體表面積為 0.006 7 m2?；鲅a腎方按人的劑量為1付/天計算，小鼠等效劑量約為0.004 付/天，將每劑中藥煎成 50 mL 湯劑，按每只小鼠每次0.19 mL 湯劑灌胃4周，每天1次。假手術(shù)組與模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 體重檢測和血清雌二醇檢測

OVX術(shù)后每2周檢測體重。骨折術(shù)后4周，通過摘眼球取血法收集各組小鼠血樣，3 000 r/min離心15 min，收集血清，按血清雌二醇檢測試劑盒說明書要求，檢測小鼠血清雌二醇水平。

1.6 Micro-CT掃描和三維重建

骨折術(shù)后4周，取小鼠腰椎與左側(cè)脛骨組織，10 %中性福爾馬林固定24 h后，以55 kV電壓、72 μA電流、300 ms/幀速率、10 μm橫斷面厚度的參數(shù)，掃描第四腰椎椎體與脛骨組織，進行三維(3 D)圖像重建，并分析骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(shù)(bone volume/ total volume，BV/TV)和骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

1.7 生物力學(xué)性能觀察

安裝Electro Force 3200 Series III測試儀支撐平臺，設(shè)定兩支撐點間距離為11.8 mm，為保證測試條件相同，該距離設(shè)置完成后，測試全程將保持不變。從生理鹽水中取出脛骨，使用無塵紙巾擦干多余水分，置于兩支撐點之間。進行三點彎曲實驗，以0.3 mm/min的速度對脛骨施加壓力，直至斷裂，斷裂時的最大應(yīng)力由儀器自動記載。

1.8 脛骨形態(tài)學(xué)觀察

將脛骨組織放入14 %中性乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣 3周后，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋后，制成4 μm 厚度組織切片，進行阿爾辛藍/橙黃G(Alcian Blue/Orange G)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠OVX前后體重變化

如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠在OVX術(shù)后4周、6周和8周時，體重顯著升高(P< 0.01)。

注：與同時間點假手術(shù)組比，** P<0.01。圖1 雙側(cè)卵巢切除(OVX)前后各組小鼠體重變化Fig.1 Changes of weight of sham mice and ovariectomized mice

2.2 小鼠雌二醇變化及腰椎骨密度變化

骨折術(shù)后4周，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清雌二醇顯著降低(圖2，P<0.01)；與模型組比較，化瘀補腎方組小鼠血清雌二醇水平顯著升高(圖2，P<0.01)。Micro-CT分析表明，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠第4腰椎松質(zhì)骨BMD顯著降低(圖3，P<0.01)；與模型組比較，化瘀補腎方組小鼠第4腰椎松質(zhì)骨BMD顯著上升(圖3，P<0.05)。Micro-CT三維重建也顯示模型組小鼠第4腰椎骨小梁稀疏，化瘀補腎方組小鼠第4腰椎較模型組明顯增多(圖4)。該部分研究表明，去卵巢小鼠血清雌二醇和腰椎骨密度顯著降低，小鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功；此外，化瘀補腎方具有提高去卵巢小鼠血清雌二醇和腰椎骨密度的作用。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 化瘀補腎方對各組小鼠第4腰椎骨密度(BMD)的作用Fig.3 Effect of Huayu Bushen Formula on bone mineral density (BMD) of the 4th lumbar vertebrae in mice

圖4 各組小鼠第4腰椎Micro-CT三維重建圖Fig.4 Three dimensional (3D) reconstruction images of 4th lumbar vertebrae of mice by Micro-CT

2.3 小鼠脛骨骨痂組織骨小梁參數(shù)變化

骨折術(shù)后4周，小鼠左側(cè)脛骨組織三維重建圖如圖5 a所示，假手術(shù)組骨折部位骨折線模糊或消失，骨痂處于塑型期；模型組骨折部位周圍仍有明顯的骨折線；化瘀補腎方組骨折部位周圍骨折線模糊，骨痂明顯。各組小鼠骨痂組織的骨小梁參數(shù)如圖5 b～e所示，模型組小鼠骨痂組織的BV/TV、Tb.N均顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)，Tb.Th也低于假手術(shù)組(P<0.05)，Tb.Sp顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；而化瘀補腎方組的BMD顯著高于模型組(P<0.01)，BV/TV、Tb.Th也高于模型組(P<0.05)，兩組間Tb.N、Tb.Sp差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：a 各組小鼠脛骨骨痂組織三維重建圖縱切面；b 骨體積分數(shù)(BV/TV)；c 骨小梁數(shù)量(Tb.N)；d 骨小梁厚度(Tb.Th)；e 骨小梁分離度(Tb.Sp)。與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 化瘀補腎方對各組小鼠脛骨骨痂組織骨小梁參數(shù)的作用Fig.5 Effects of Huayu Bushen Formula on bone trabecular parameters of tibial callus in mice

2.4 小鼠脛骨生物力學(xué)性能

由三點彎曲實驗所得的脛骨最大應(yīng)力是衡量脛骨最大負載能力的重要參數(shù)之一。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脛骨的最大應(yīng)力在骨折術(shù)后28 d時顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)；化瘀補腎方組小鼠脛骨的最大應(yīng)力顯著高于模型組(P<0.01)。提示卵巢切除后，小鼠脛骨的最大負載能力和抗骨折性能降低，而化瘀補腎方能提高卵巢切除小鼠脛骨的最大負載能力和抗骨折性能(圖6)。

注：與假手術(shù)組比較，**P < 0.01；與模型組比較，## P < 0.01。圖6 化瘀補腎方對小鼠脛骨最大應(yīng)力的作用Fig.6 Effect of Huayu Bushen Formula on ultimate stress of tibias in mice

2.5 小鼠脛骨骨痂組織形態(tài)學(xué)變化

小鼠脛骨骨痂組織Alcian Blue/Orange G染色顯示，骨折術(shù)后4周，假手術(shù)組和化瘀補腎方組小鼠脛骨骨痂處于塑形期，骨痂組織內(nèi)明顯骨小梁形成，而模型組小鼠骨痂組織中有較多脂肪組織，骨小梁稀疏。提示化瘀補腎方能提高去卵巢小鼠骨痂組織的骨形成，改善組織病理學(xué)狀態(tài)(圖7)。

圖7 化瘀補腎方對各組小鼠脛骨骨痂組織形態(tài)的作用Fig.7 Effect of Huayu Bushen Formula on the histomorphological changes of tibial callus in mice

3 討論

OPF愈合過程與正常骨折相似，但愈合延遲的機率遠高于常人，動物實驗也證明卵巢切除后大鼠骨折愈合延遲，且骨折愈合質(zhì)量差[7]。這可能與絕經(jīng)后骨折狀態(tài)下骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)的募集、增殖和成骨能力降低有關(guān)[8]。女性絕經(jīng)后，衰老、雌激素缺乏、炎性細胞因子增加，都可以引起 BMSCs 的衰老凋亡、削弱其增殖和成骨能力。本研究也顯示，OVX術(shù)后4周開始去卵巢小鼠體重明顯升高；骨折術(shù)后4周，相較于假手術(shù)組小鼠，模型組小鼠血清雌二醇明顯降低，骨密度等骨量參數(shù)也隨之降低。而化瘀補腎方組小鼠血清雌二醇顯著高于模型組，且接近于假手術(shù)組，提示化瘀補腎方可改善卵巢切除導(dǎo)致的小鼠雌激素水平下降。

目前治療POP的方法一方面是通過刺激成骨細胞分化，促進骨生成，另外一個方面是抑制破骨細胞的骨吸收。目前臨床常用藥物雖有一定療效，但仍存在諸多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥已被證實可有效治療POP，其優(yōu)勢是能夠同時增加骨生成和抑制骨吸收，延緩骨量丟失，改善POP 患者的骨質(zhì)疏松病變[9]。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“年四十，而陰氣自半，起居衰矣”，中醫(yī)認為人在中年以后，體內(nèi)陰津陰液虧虛，而“陽在外，陰之使也”，陰液虧虛從而導(dǎo)致陽之主動的功能降低，身體活動能力下降。中老年患者體內(nèi)陰液陰津常處于不足狀態(tài)，而腎陰一部分來源于五臟六腑之陰，久病及腎，因此中老年患者多處于腎陰虛的狀態(tài)。而當中老年患者遭受外傷或其他原因?qū)е鹿钦郯l(fā)生時，腎陰虛是需要考慮的一個基本病機，骨折局部瘀血阻滯，津液運行失調(diào)，引起局部多瘀多濕之標。

根據(jù)此病機變化，本研究采用施杞教授臨床治療中老年患者血瘀腎虛型骨折的化瘀補腎方。方中以丹參、女貞子為君藥，活血化瘀止痛“以血為先”治其標，兼以滋補肝腎之陰治其本，標本兼治。臣以墨旱蓮、淫羊藿，墨旱蓮與君藥女貞子配合形成二至丸，增強滋補肝腎之功，而淫羊藿用于此處目的在于“陽中求陰”。以骨碎補為佐，既可補肝腎，強筋骨，又可活血療傷止痛，從而增強君臣之功。妙用獨活為使藥，因獨活歸腎經(jīng)，一方面作為引經(jīng)藥使補腎之藥效歸于腎；另一方面，獨活亦可祛濕止痛，以去除骨折局部因瘀產(chǎn)生之濕邪，并緩解疼痛。骨折愈合過程可分為血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期以及骨痂塑形期三個階段。由成骨細胞介導(dǎo)的骨形成在骨折愈合過程中發(fā)揮了重要作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明化瘀補腎方中的多種有效組分對骨形成具有調(diào)節(jié)作用。丹參酮IIA可促進前成骨細胞MC3T3-E1的分化，增加MC3T3-E1細胞中Runx2和Osterix蛋白的表達[10]。我們的前期研究表明女貞子、墨旱蓮中的有效組分齊墩果酸能夠劑量依賴性地抑制Notch信號通路活性，增強BMSCs的成骨分化能力和異位成骨能力[11]；此外，齊墩果酸還可以通過抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞生成，減少小鼠骨量丟失[12]。淫羊藿的有效組分淫羊藿苷可通過雌激素途徑恢復(fù)OVX小鼠BMSCs的成骨分化能力[13]。骨碎補的有效組分木犀草素，可以改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松性大鼠的骨小梁微結(jié)構(gòu)，提高骨密度、血清堿性磷酸酶活性以及骨保護素的mRNA表達，其作用可能與調(diào)節(jié)ERK/Lrp-5/GSK-3β通路有關(guān)[14]。獨活提取物蛇床子素通過激活β-catenin/BMP信號通路刺激成骨細胞分化和骨形成，改善卵巢切除小鼠骨的生物力學(xué)性能[15]。