袁國棟 孫中洋 王宇翔 魚鑫 趙建寧 許斌*

1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009 2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210002

世界衛(wèi)生組織定義骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞而導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)提出骨質(zhì)疏松癥的兩個特征是骨強度下降和骨折風(fēng)險增加。骨強度反映骨骼的兩個方面即骨密度和骨質(zhì)量。骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重后果是發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折(脆性骨折)，即在受到輕微創(chuàng)傷或日?；顒又屑纯砂l(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松性骨折的常見部位是脊椎、髖部和前臂遠(yuǎn)端。骨質(zhì)疏松是一種退行性疾病，隨年齡的增長患病風(fēng)險增高。我國是世界上老年人口絕對數(shù)量最多的國家，隨著人民壽命延長和老齡化社會的到來，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為我國社會的重要健康問題。

1 m6A

N6-甲基腺苷(m6A)是位于腺苷N6位點的一種動態(tài)甲基化修飾，其于二十世紀(jì)七十年代被首次發(fā)現(xiàn)，是真核生物mRNA中最普遍的內(nèi)部修飾。m6A多位于3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，在終止密碼子附近富集，CDS區(qū)(編碼區(qū))也有分布[2-3]。m6A修飾位點有一定的序列特征，通常為DR m6A CH(D=A、G或U；R=G或A；H=A、C或U)。m6A修飾過程發(fā)生于核斑點，影響著mRNA代謝過程的各個階段如mRNA的剪接[4]、結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換[5]、轉(zhuǎn)運[6]、翻譯[7-10]和降解[11](圖1)。除mRNA外，m6A修飾還對非編碼RNA[如miRNA[12]、lncRNA[16]，rRNA[13]、tRNA[14]、snRNA(核小RNA)[15]等]具有重要的調(diào)節(jié)功能，比如pri-miRNA(初級miRNA)上的m6A修飾可推動其加工成pre-miRNA(miRNA前體)和成熟的miRNA。一些lncRNA上也存在m6A如Malat1、Neat1、Hotair、XIST(X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物), XIST上的m6A修飾可促進(jìn)XIST介導(dǎo)的X染色體失活[16]。m6A由m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化形成，甲基的供體是S腺苷甲硫氨酸(SAM)，該復(fù)合體由甲基轉(zhuǎn)移酶3(METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶14(METTL14)、Wilms瘤1相關(guān)蛋白(WTAP)[17]、Vir樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(KIAA1429 / VIRMA)[18]、含CCCH結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白13(ZC3H13)[19]、HAKAI(一種E3泛素連接酶)[20]、RNA結(jié)合基序蛋白15(RBM15)及其旁系同源蛋白RBM15B[21]共同組成。在m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中，METTL3和METTL14形成一個異二聚體[22-23]，其中METTL3有催化活性，而METTL14在結(jié)構(gòu)上對METTL3起到支持作用。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的其余組成成分則通過直接或間接與異二聚體的相互作用起到“writer”的作用，而各個蛋白是否具有其特定的功能有待進(jìn)一步研究。Alkb家族蛋白的兩個成員FTO和ALKBH5是m6A的“eraser”，正如它的命名一樣，F(xiàn)TO(脂肪和肥胖相關(guān)基因)最開始被人們熟知是因為其是脂肪形成和肥胖中的關(guān)鍵基因。2011年美國芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊首先發(fā)現(xiàn)FTO是一個m6A的“eraser”，而正是這個發(fā)現(xiàn)讓人們認(rèn)識到m6A有著動態(tài)調(diào)控機制。但是，最新的研究表明FTO對m6Am去甲基化活性高于m6A[24]，所以有學(xué)者認(rèn)為實際上ALKBH5是主要的m6A的“eraser”。m6A對mRNA代謝過程的調(diào)控是通過m6A的“reader”蛋白識別m6A位點繼而發(fā)揮相應(yīng)功能實現(xiàn)的，“reader”蛋白主要包括YTHDF1-3和YTHDC1-2，它們都是YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白。YTHDF1可以調(diào)節(jié)mRNA的翻譯[7]，YTHDF2介導(dǎo)mRNA的降解[25]，而YTHDF3同時具備這兩種功能[26]。另外，METTL3也有“reader”的功能，其可以促進(jìn)翻譯[9]。YTHDC2在睪丸中富集，在精子形成過程中起重要作用并可以促進(jìn)mRNA的翻譯[27]。而作為核內(nèi)的“reader”，YTHDC1有促進(jìn)mRNA剪接和出核的功能[4,6]。m6A在許多疾病和病理生理過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用如腫瘤發(fā)生[28]、白血病[29]、心肌重塑[30]、胚胎發(fā)育[31]、HSC(造血干細(xì)胞))分化等[32]。越來越多的證據(jù)表明，m6A對BMSCs的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，m6A代謝的紊亂也可能是骨質(zhì)疏松癥的潛在發(fā)病機制。在本文中，我們總結(jié)歸納了有關(guān)m6A與BMSCs分化以及骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系的最新研究成果，提示m6A可能是骨質(zhì)疏松癥潛在的治療靶點。

圖1 存在m6A的mRNA的代謝過程Fig.1 Metabolic process of mRNA with m6A

2 m6A調(diào)節(jié)BMSCs成脂分化與成骨分化之間的轉(zhuǎn)換

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生如骨、脂肪、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱等。臨床研究表明，肥胖與骨質(zhì)疏松癥經(jīng)常并存，并可能有因果關(guān)系[33-35]，而骨質(zhì)疏松癥的一個重要特征便是脂肪組織在骨髓中的積累。Wu等[36]發(fā)現(xiàn)在BMSCs中條件敲除METTL3會導(dǎo)致小鼠骨量的降低以及骨髓中脂肪組織的積累，而從小鼠骨髓中分離出的BMSCs成脂分化潛能增加，成骨分化潛能降低。在機制上，Yao等[37]的研究表明METTL3是通過JAK1/STAT5/C/EBPβ通路抑制BMSCs成脂分化的，在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)METTL3與JAK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其中YTHDF2參與了這個過程，其促進(jìn)了JAK1的mRNA的降解，進(jìn)而激活JAK1/STAT5/C/EBPβ通路。Shen等[38]研究發(fā)現(xiàn)GDF11-FTO-PPARγ通路可以促進(jìn)BMSCs的成脂向分化。FTO的mRNA水平在BMSCs成骨向分化過程中下降而在成脂向分化中上升。在成骨細(xì)胞中條件敲除FTO可以緩解小鼠OVX(去卵巢)造模造成的骨小梁減少，骨小梁分離度增大等表型，而敲除FTO本身并不會使成骨功能指標(biāo)上升。另外，與對照OVX小鼠相比，從敲除FTO的OVX小鼠骨髓中分離出的BMSCs成脂分化潛能降低，成骨分化潛能增加。在FTO的上游調(diào)控機制上，Li等[39]報道m(xù)iR-149-3p可以靶向FTO進(jìn)而起到調(diào)節(jié)BMSCs成脂分化與成骨分化之間的轉(zhuǎn)換的作用。綜上所述，BMSCs中的m6A修飾在調(diào)節(jié)其成骨分化和成脂分化之間的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用，METTL3促進(jìn)BMSCs成骨向分化，抑制其成脂向分化而FTO則相反。

3 m6A調(diào)節(jié)BMSCs成骨向分化的機制

多種信號通路調(diào)節(jié)著BMSCs的成骨向分化如Wnt/β-catenin通路、MAPK通路、BMPs/Smad通路、PI3K-Akt通路、Notch通路等，而m6A修飾可以通過改變這些通路中的重要分子的表達(dá)水平而參與對BMSCs的成骨向分化的調(diào)控。Tian等[40]報道在BMSCs成骨向分化過程中METTL3的表達(dá)增加。在機制上，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)敲低METTL3通過抑制PI3K-Akt通路從而阻遏了BMSCs細(xì)胞的成骨向分化。VEGF(血管生成因子)與成骨細(xì)胞的成熟有關(guān)，研究人員發(fā)現(xiàn)METTL3可以影響VEGF的mRNA的剪接，在BMSCs中敲低METTL3后，剪接體VEGF-188的mRNA表達(dá)水平降低而VEGF-120沒有明顯變化，而有文獻(xiàn)報道前者參與了BMSCs成骨向分化的過程。PTH(甲狀旁腺素)能調(diào)節(jié)骨代謝和骨穩(wěn)態(tài)，有研究報道PTH可以通過Notch信號通路調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化。PTH1r(甲狀旁腺素1型受體)對PTH的功能至關(guān)重要，一種治療老年女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的新藥阿巴洛肽的藥理機制便是選擇性激活PTH / PTH1r信號軸，在上文提到的Wu等的研究中發(fā)現(xiàn)PTH / PTH1r信號軸是METTL3促進(jìn)BMSCs成骨向分化的下游通路。該研究中發(fā)現(xiàn)在BMSCs條件敲除METTL3抑制了PTH1r的翻譯。不過，研究人員沒有進(jìn)一步探索是哪個m6A的“reader”介導(dǎo)了這個過程。Yan等[41]通過MeRIP芯片測序在敲低METTL3的BMSCs中篩選出了有顯著變化的pri-miRNA和pre-miRNA，在這其中pre-miR-320的m6A水平最高因而研究人員關(guān)注了這個miRNA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲低METTL3使pre-miR-320和miR-320的表達(dá)升高而miR-320可以直接靶向BMSCs成骨向分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2繼而抑制其成骨向分化，而敲除METTL3本身也可使Runx2的mRNA和蛋白水平降低，YTHDF1介導(dǎo)了這個過程。因此作者總結(jié)METTL3可以通過上述兩種機制調(diào)節(jié)BMSCs的成骨向分化。但是，據(jù)報道pri-miRNA上的m6A被“reader”蛋白HNRNPA2B1(異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A2B1)識別后可促使其加工成pre-miRNA和成熟的miRNA[42]，所以METTL3實際上是參與了miRNA的成熟過程，而這無法解釋上述研究中敲低METTL3后pre-miR-320和miR-320的mRNA水平升高的現(xiàn)象，其內(nèi)在的機制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，m6A可以通過多種機制調(diào)節(jié)BMSCs的成骨向分化。

4 m6A調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生

骨質(zhì)疏松癥可以發(fā)生在不同性別和任何年齡，但多見于絕經(jīng)后婦女和老年男性。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(I型)、老年性骨質(zhì)疏松癥(Ⅱ型)和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(包括青少年型)3類。其中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥一般發(fā)生在婦女絕經(jīng)后5～10年內(nèi)；老年性骨質(zhì)疏松癥一般指老年人70歲后發(fā)生的骨質(zhì)疏松。多項研究表明m6A可能參與了這兩種骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程。早期的臨床研究報道FTO基因的常見變異與骨密度(BMD)以及女性髖部骨折風(fēng)險相關(guān)[43-44]。Gregor等[45]構(gòu)建了點突變的FTO基因的小鼠模型(FTO-R313A)，突變點位于精氨酸-313，其對FTO的酶活性至關(guān)重要。研究人員發(fā)現(xiàn)FTO-R313A小鼠的身長、體重、脂肪質(zhì)量、瘦肉質(zhì)量與野生型小鼠相比較小而身體成分的比例未發(fā)生明顯變化。不過，F(xiàn)TO-R313A小鼠的BMD和骨礦物質(zhì)量(BMC)都有下降，因此FTO對骨骼生長和骨礦化有重要作用。Zhang等[46]則構(gòu)建了FTO全敲除的小鼠模型(FtoKO)，在12周和30周時小鼠都呈現(xiàn)與上述研究相似的表型。除此之外研究人員同時構(gòu)建了在成骨細(xì)胞中條件敲除FTO的小鼠模型(FtoOc KO)，他們發(fā)現(xiàn)FtoOc KO小鼠的身長、體重等指標(biāo)較野生型小鼠沒有明顯改變，12周時骨量也沒有明顯變化。而在30周時，F(xiàn)toOc KO小鼠的骨量才顯著降低，這提示FTO可能參與了Ⅱ型骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程而FtoKO小鼠的骨表型可能一部分是小鼠新陳代謝的改變造成的。前文提及Shen等的研究中FtoOc KO小鼠和野生型小鼠的骨表型則沒有明顯差異，與以上兩個研究結(jié)果相悖，基于該研究小鼠骨表型的數(shù)據(jù)不夠全面，說服力較弱。值得一提的是，Zhang等的研究中作者發(fā)現(xiàn)FTO的mRNA水平在原代成骨細(xì)胞分化過程中升高而在Shen等的研究中提到FTO的mRNA水平在BMSCs成骨向分化過程是下降的。BMSCs是原代成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，因此原代成骨細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是BMSCs成骨向分化的一個階段。因此，F(xiàn)TO可能在BMSCs不同的分化階段發(fā)揮著不同功能：在BMSCs分化前期調(diào)節(jié)其成脂分化與成骨分化之間的轉(zhuǎn)換而在其成骨向分化后期起到促進(jìn)成骨向分化的作用。不過，F(xiàn)TO功能發(fā)生變化的時間點以及功能轉(zhuǎn)變的內(nèi)在的機制尚不清楚。Wu等的研究中用CRISPR-Cas9技術(shù)分別構(gòu)建了在BMSCs中條件敲除和敲入METTL3的模型小鼠(Mettl3KO和 Mettl3KI)。Mettl3KO小鼠骨量減少，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥的骨表型而METTL3敲入則可以緩解由于小鼠OVX造模所致的骨量丟失，這提示METTL3可能調(diào)控了Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。另外，研究者還注意到METTL3的敲除也使得破骨細(xì)胞功能上升而在Mettl3KI小鼠中則沒有改變。Yan等發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松病人骨組織的總體m6A水平下降且METTL3和METTL14的mRNA水平降低而FTO和ALKBH5無明顯改變。在這項工作中，研究人員構(gòu)建了整體敲除和過表達(dá)METTL3的模型小鼠而得到了和上述研究相似的結(jié)果。綜上所述，雖然METTL3和FTO分別是m6A的“writer”和“eraser”，看似作用相悖，但它們都對骨形成有重要作用，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程中扮演著重要角色。

5 總結(jié)與展望

目前來看，在骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域m6A相關(guān)的研究較少且都集中在m6A對BMSCs和成骨細(xì)胞成骨向分化的調(diào)控機制上。m6A是通過調(diào)節(jié)哪些下游分子的表達(dá)從而參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生還不明晰，所以未來還應(yīng)該開展更多的相關(guān)研究完善m6A調(diào)控骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機制。最近的一項研究[47]報道METTL3對破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能也有調(diào)節(jié)作用。這樣的結(jié)果并不讓人意外，因為m6A在真核細(xì)胞mRNA中十分常見，調(diào)控過程也極其復(fù)雜。m6A在不同的病理生理過程中可能影響著不同的關(guān)鍵正向或負(fù)向調(diào)節(jié)因子mRNA或蛋白水平的表達(dá)，因此同一個m6A的“writer”、“eraser”或“reader”很有可能同向調(diào)控兩個作用相反的病理生理過程。我們認(rèn)為未來在m6A對骨質(zhì)疏松癥調(diào)節(jié)機制的研究上不應(yīng)局限于METTL3和FTO，其他m6A的“writer”、“eraser”或“reader”或許也會通過不同途徑參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生?？傊?，m6A對BMSCs分化和骨質(zhì)疏松癥有重要的調(diào)節(jié)作用，m6A可能是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點。