吳春根 陳平 吳雯昱 譚利琴*

1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院疼痛科，江西 南昌 330003 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的全身性骨病，多發(fā)于老年人群，其特點是骨量逐漸減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨質(zhì)脆性，會造成患者全身骨骼疼痛、軀體功能下降、嚴重影響人們的日常生活質(zhì)量。正清風(fēng)痛寧的主要成分是青藤堿，是從中草藥青風(fēng)藤中提取的一種單體生物堿，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[1-2]，治療骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等引起的疼痛性疾病療效得到廣泛認可[3-4]，但其在抗骨質(zhì)疏松方面的研究卻鮮有報導(dǎo)。諸多研究表明氧化應(yīng)激也參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程，核因子 E2 相關(guān)因子 2(Nrf2)是抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，有報道表明Nrf2 在骨發(fā)育代謝中也發(fā)揮重要角色[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)作為調(diào)控線粒體形態(tài)功能的一個重要蛋白質(zhì)，不但能促進成骨分化，還能抑制破骨分化，在調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松進程中發(fā)揮重要作用[6]?；诖耍狙芯恳源姿釢娔崴烧T導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠，觀察正清風(fēng)痛寧對模型大鼠的改善作用，并通過Nrf2/SIRT3/SOD2途徑探討其內(nèi)在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：40 只雄性 SD 大鼠，3 月齡，體重280～340 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2藥物與試劑：正清風(fēng)痛寧片(四川太極制藥有限公司，規(guī)格：20 mg，國藥準(zhǔn)字Z51020160)；醋酸潑尼松(廣東華南藥業(yè)，批號 060328)；堿性磷酸酶(ALP)、降鈣素(CT)、丙二醇(MDA)、超氧化物歧化酶2(SOD2)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；Ⅰ型膠原羧基末端交聯(lián)肽(β-CTX)、骨鈣素(BGP)(德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；DAB蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(上海宏盛)；β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體(Sigma)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；Western blot增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)。

1.1.3儀器：PLODIGY 型骨密度儀(美國Lunar 公司)；超聲勻漿器(日本SANYO公司)；低溫高速離心機(美國IEC公司)；X73型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMOUS公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型制備：80只雌性SD大鼠隨機分為4組：正常對照組、骨質(zhì)疏松組、正清風(fēng)痛寧組、對照藥白藜蘆醇組，每組20只。除正常對照組外，其余大鼠灌胃給予醋酸潑尼松[5 mg/(kg·d)]，用0.5 % CMC-Na配成0.5 mg/mL的濃度，給藥體積10 mL/kg，每周2次，4周后正清風(fēng)痛寧組和對照藥組分別給予正清風(fēng)痛寧[20 mg/(kg·d)]和白藜蘆醇[5 mg/(kg·d)]，用0.5 % CMC-Na配制，濃度分別為2 mg/mL和0.5 mg/mL，給藥體積為10 mL/kg，正常對照組每日給等量的0.5 % CMC-Na溶液，以上給藥每日一次，連續(xù)給藥8周。

1.2.2取材：血樣收集：大鼠末次給藥后，禁食24 h，次日用3 %戊巴比妥鈉(5 mg/kg)腹腔注射麻醉，右心室徹底抽血處死。收集血液后，4 ℃ 靜置3 h，3 000 r/min離心10 min，血清分裝于小EP管中，-70 ℃冷凍備用。

骨標(biāo)本收集：大鼠處死后，取兩側(cè)股骨和第五椎體(L5)，剔除肌肉及筋膜(保留骨膜)等軟組織，右股骨和L5用生理鹽水沖洗，用生理鹽水浸潤的醫(yī)用紗布包裹，再用錫紙包裹，置-70 ℃冰箱凍存，用作骨密度及股骨近端孔隙檢測。

左側(cè)股骨經(jīng)脫鈣后制備石蠟切片，用作HE染色、Western blot 檢測。

1.2.3血清ALP、CT水平測定：ELISA 法檢測血清ALP、CT水平。檢測步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4血清β-CTX、BGP水平檢測：電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清 β-CTX、BGP 水平，檢測步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.2.5血清SOD2、MDA水平測定：ELISA 法檢測血清SOD2、MDA水平。檢測步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.2.6骨密度、股骨近端孔隙率檢測：用骨密度儀測量各組大鼠L5和右股骨的骨密度(BONe mineral density，BMD)及股骨近端孔隙率。

1.2.7HE染色觀察股骨結(jié)構(gòu)的病理改變：取大鼠左股骨，剔除肌肉組織及筋膜，置于10 %中性甲醛固定72 h，然后再放入10 % EDTA (pH 7.4)溶液3個月進行脫鈣，每周更換1次脫鈣液。完成后沖水 24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.8Western blot 測定各組大鼠的骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白的表達情況：股骨低溫研磨破碎，加入RIPA 裂解液提取組織蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)量濃度。取少量蛋白質(zhì)配成上樣緩沖液，加入15 %的 SDS-PAGE 電泳膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜，5 %的脫脂牛奶封閉 1 h，加入一抗Nrf2(1∶1 000)、SIRT3(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育 2 h，用 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，化學(xué)發(fā)光成像，以相應(yīng)的 β-actin 作為內(nèi)參，用 Image J 圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量分析，計算各目標(biāo)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清ALP、CT水平

骨質(zhì)疏松組大鼠血清ALP、CT水平均明顯低于正常對照組(P<0.01)，正清風(fēng)痛寧組ALP、CT水平較骨質(zhì)疏松組顯著升高(P<0.01)，見圖1。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，## P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，** P<0.01。圖1 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠血清ALP、CT水平的影響Fig.1 The effect of Zhengqingfengtongning on serum ALP and CT content in osteoporotic rats

2.2 血清β-CTX、BGP水平

骨質(zhì)疏松組大鼠血清 β-CTX水平明顯高于正常對照組，BGP水平明顯低于正常對照組(P<0.01)，正清風(fēng)痛寧組大鼠血清 β-CTX水平較骨質(zhì)疏松組明顯降低，BGP水平較骨質(zhì)疏松組顯著升高(P<0.01)，見圖2。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，## P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠血清 β-CTX、BGP水平的影響Fig.2 The effect of Zhengqingfengtongning on serum β-CTX and BGP content in osteoporotic rats

2.3 血清MDA、SOD2水平

骨質(zhì)疏松組大鼠血清MDA水平明顯高于正常對照組，SOD2活性明顯低于正常對照組，(P<0.01)，正清風(fēng)痛寧組大鼠血清MDA水平較骨質(zhì)疏松組明顯降低，SOD2活性較骨質(zhì)疏松組明顯升高(P<0.01)，見圖3。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠血清MDA、SOD2水平的影響Fig.3 The effect of Zhengqingfengtongning on serum MDA and SOD2 levels in osteoporotic rats

2.4 骨密度

骨質(zhì)疏松組大鼠BMD明顯低于正常對照組(P<0.05)，正清風(fēng)痛寧組大鼠BMD較骨質(zhì)疏松組明顯升高(P<0.01)，見圖4。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，## P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，** P<0.01。圖4 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠BMD的影響Fig.4 The effect of Zhengqingfengtongning on BMD of osteoporotic rats

2.5 股骨近端孔隙率

骨質(zhì)疏松組大鼠股骨近端孔隙率明顯高于正常對照組(P<0.05)，正清風(fēng)痛寧組大鼠股骨近端孔隙率較骨質(zhì)疏松組明顯降低(P<0.01)，見圖5。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，## P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，** P<0.01。圖5 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠股骨近端孔隙率的影響Fig.5 The effect of Zhengqingfengtongning on the porosity of the proximal femur of rats with osteoporosis

2.6 股骨結(jié)構(gòu)的病理改變

與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠骨小梁斷裂、變細、結(jié)構(gòu)紊亂且數(shù)目減少。與骨質(zhì)疏松組比較，正清風(fēng)痛寧組大鼠骨小梁明顯增粗、數(shù)量增多且結(jié)構(gòu)完整，排列有序，但與空白對照組比較尚未完全恢復(fù)。見圖6。

圖6 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠股骨結(jié)構(gòu)病理改變的影響(200×)Fig.6 Effect of Zhengqing Fengtongning on the Pathological Changes of Femoral Structure in Rats with Osteoporosis(200×)

2.7 骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白的表達

骨質(zhì)疏松組大鼠骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白表達明顯低于正常對照組(P<0.01)，正清風(fēng)痛寧組大鼠骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白表達較骨質(zhì)疏松組明顯升高(P<0.01)，見圖7。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，## P<0.01；與骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05，** P<0.01。圖7 正清風(fēng)痛寧對骨質(zhì)疏松大鼠股骨近端孔隙率的影響Fig.7 Effect of Zhengqing Fengtongning on the Porosity of Proximal Femur in Rats with Osteoporosis

3 討論

正清風(fēng)痛寧的主要成分是青藤堿，有研究[7]報道青藤堿對于膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的骨破壞有明顯改善作用，另外顯示其在樹突狀細胞中也發(fā)揮作用，這些都表明青藤堿可能抑制骨破壞的發(fā)展程度，正清風(fēng)痛寧為青藤堿中藥制劑，臨床廣泛用于治療各類風(fēng)濕疾病，療效較好，且不良反應(yīng)小。

骨質(zhì)疏松癥是由于骨吸收的增加及骨形成的減少及鈣磷等物質(zhì)代謝失衡導(dǎo)致的一種全身性骨病，對人們的日常生活影響較大。諸多研究[8-11]顯示氧化應(yīng)激可能參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程，氧化應(yīng)激是由于過量活性氧產(chǎn)生的，會損傷成骨細胞的細胞成分，并被認為是老年性骨質(zhì)疏松癥中成骨細胞骨形成的關(guān)鍵起始因素。有研究[12]發(fā)現(xiàn)老年性骨質(zhì)丟失與骨中氧化應(yīng)激水平的逐漸增加有關(guān)。

Nrf2 是調(diào)節(jié)細胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2 能同時調(diào)控成骨細胞與破骨細胞的分化和功能，參與骨代謝的過程。有報道[13]顯示Nrf2 可以通過調(diào)節(jié)活性氧的信號水平誘導(dǎo)破骨細胞的形成。在細胞實驗中也發(fā)現(xiàn)，在 Nrf2 缺失條件下成骨細胞系無法鈣化和分化，而在破骨過程中，減少Nrf2 表達后ROS 水平明顯增加，破骨細胞數(shù)量也明顯增加，過表達 Nrf2后破骨細胞的數(shù)量明顯減少[14]。

SIRT3 可以調(diào)控線粒體的形態(tài)功能，其特性主要表現(xiàn)在能夠增加SOD活性，降低細胞的自由基水平，提高機體的抗氧化應(yīng)激能力[15]。在骨代謝疾病中，SIRT3既能夠促進成骨分化，又能夠抑制破骨分化，同時延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)展。研究[16]顯示，過表達SIRT3后可以通過激活SIRT3/PGC-1α/SOD2信號通路降低ROS的水平，促進干細胞的成骨分化。另一方面核因子κ B受體(RANK)及其配體的結(jié)合也會導(dǎo)致 SIRT3表達代償性上調(diào)，進一步抑制破骨細胞的分化[17]。

SOD2是一種特定位于線粒體內(nèi)的SOD，是一種抑制線粒體活性氧的清除酶[18]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT3可以通過上調(diào)線粒體內(nèi) SOD2 的表達而提高線粒體清除活性氧能力，參與相關(guān)疾病的發(fā)生[19]。ALP 是成骨細胞的一種胞外酶，其與成骨細胞和破骨細胞的活性變化相關(guān)，是有效反映骨形成代謝的代表性指標(biāo)[20]。血清降鈣素是甲狀腺濾泡旁細胞分泌的一種肽類激素，可以調(diào)節(jié)成骨細胞的活性而促進骨形成，同時還可以抑制破骨細胞的活性和形成，從而抑制骨的吸收[21]。

本研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組大鼠血清ALP、降鈣素水平及SOD2活性明顯降低，MDA水平明顯升高，骨密度明顯降低，股骨近端孔隙率明顯升高，HE染色顯示骨小梁變細、斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂且數(shù)量減少，骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白表達明顯降低，提示模型組大鼠存在明顯的骨代謝失衡及氧化應(yīng)激損傷。給予正清風(fēng)痛寧治療12周后，大鼠血清ALP、降鈣素水平及SOD2活性明顯升高，MDA水平明顯降低，骨密度明顯升高，股骨近端孔隙率明顯降低，骨小梁明顯增粗、排列整齊且數(shù)量明顯增加，骨組織結(jié)構(gòu)有明顯改善，骨組織中Nrf2、SIRT3蛋白表達明顯升高。說明正清風(fēng)痛寧可以激活Nrf2/SIRT3/SOD2 信號通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而促進成骨分化以及抑制破骨分化，發(fā)揮緩解骨質(zhì)疏松的作用。

綜上所述，正清風(fēng)痛寧可以明顯改善醋酸潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，其可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/SIRT3/SOD2 信號通路來實現(xiàn)的。