鄭 昕，張彥青，張 華，唐文勇

（1.深圳鵬城技師學(xué)院 健康管理學(xué)院，廣東 深圳 518040；2.中國食品工業(yè)發(fā)酵研究院有限公司，北京 100027；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 圖書館信息部，河南 鄭州 450002；4.深圳市愛釀生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518118）

有機酸不僅是啤酒風(fēng)味的影響因子之一[1]，也是啤酒感官品評中酸味的主要來源[2-4]，同時還決定了啤酒總酸含量、pH值等理化指標。啤酒中的有機酸主要來源于麥芽、酒花等原材料[5]，啤酒中適度的酸能夠使酒體具有緩沖性，對啤酒風(fēng)味起到穩(wěn)定的作用[4]；釀造過程中有機酸的變化規(guī)律以及后發(fā)酵階段有機酸含量的控制也是釀造工藝合理性的評價指標[6-7]。因此，有機酸的組成與含量分析近年來受到越來越多的啤酒生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注。

目前GB/T 4927—2008《啤酒》對啤酒總酸含量有具體要求，但尚未有啤酒中有機酸含量的測定方法。GB 5009.157—2016《食品有機酸的測定》適用于果汁及果汁飲料、碳酸飲料、固體飲料等食品，但不包含啤酒。啤酒有機酸分析的方法有電位滴定法[8]、分光光度法、離子色譜法[9-11]等，但一般前處理步驟繁瑣，且能同時分離的有機酸種類較少[4]。氣相色譜法進行有機酸分析時，由于有機酸的沸點較高、不易氣化，因此需要先對其衍生再進行測定[12-13]；同時又因有機反應(yīng)不易定量而直接影響測定結(jié)果的準確性。反相高效液相色譜法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析啤酒[14-15]、黃酒[16]、果酒[17-18]、蘋果醋[19]等發(fā)酵食品中有機酸組成及含量，方法簡便、準確度高，具有較好的選擇性且分析時間短。

本研究建立一種RP-HPLC分析啤酒中有機酸含量的方法，針對影響有機酸分離效果的主要因素如檢測波長、流動相、流速等進行考察，確定RP-HPLC分析測定啤酒中9種有機酸組成的優(yōu)化條件，并將該方法應(yīng)用到啤酒釀造過程中有機酸組成及含量檢測，結(jié)合發(fā)酵機理對發(fā)酵液中的有機酸組成進行了RP-HPLC動態(tài)分析，以期為最終改善啤酒過酸的現(xiàn)象、改進釀造工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌10°啤酒樣品（酒精度4.2%vol；總酸含量1.1 mL/100 mL；pH 4.3）、主酵至后酵階段共10 d發(fā)酵液（為該品牌10度啤酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液樣品）；甲醇（色譜純）、乙酸、磷酸、磷酸二氫鉀（KH2PO4）（均為分析純）：上海恒信化學(xué)試劑有限公司；草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、抗壞血酸、檸檬酸、琥珀酸標準品（純度均＞99%），美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100型高效液相色譜儀（配有G1314可變波長紫外檢測器（variable wavelength detector，VWD）、LiChrospher 100RP-18反相色譜柱（5μm，250mm×4mm）、BONDⅡODS-C18固相萃取柱（規(guī)格100 mg/mL）：美國安捷倫公司；350型pH計：瑞士Mettler公司；Millipore Synergy185超純水設(shè)備、0.45 μm混合纖維素酯微孔濾膜及微孔過濾器、SEP-PAK C18Cartridge固相萃取柱（規(guī)格500 mg/3 mL）：德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標準品溶液及流動相的配制

有機酸混合標準樣品溶液的配制：精密稱取草酸（49.0 mg）、乳酸（158.8 mg）、酒石酸（141.8 mg）、乙酸（154.0 mg）、蘋果酸（150.6 mg）、檸檬酸（159.6 mg）、α-酮戊二酸（5.0 mg）、抗壞血酸（39.8 mg）、檸檬酸（159.6 mg）、琥珀酸（200.2 mg）9種有機酸標準品，置于1 000 mL容量瓶中，用超純水溶解、充分混勻并定容至1 000 mL。配制成有機酸混合標準樣品溶液[4，20]。

流動相溶液的配制：精密稱取13.609 g KH2PO4置于1000mL容量瓶中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0后定容至1000mL，最終配制的KH2PO4溶液濃度為0.10 mol/L?；靹蚝蠼?jīng)0.45 μm混合纖維樹酯膜抽真空進行過濾、脫氣后使用[4，16]。

1.3.2 樣品預(yù)處理

啤酒樣品預(yù)處理：啤酒在（20±0.5）℃水浴中靜置平衡后，吸取4 mL酒液，加入超純水于10 mL容量瓶中定容。再經(jīng)混合纖維樹酯膜（0.45 μm）過濾得到啤酒樣品。經(jīng)SEPPAK C18Cartridge固相萃取柱處理后進樣。

發(fā)酵液預(yù)處理：發(fā)酵液取樣自主發(fā)酵第1天起至后發(fā)酵期，共10 d，對釀造過程有機酸含量進行動態(tài)分析。取100 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，吸取上清液并在（20±0.5）℃水浴中平衡。平衡后的樣品經(jīng)濾紙過濾后，吸取4 mL上清液，用超純水定容至10 mL。再經(jīng)混合纖維樹酯膜（0.22 μm）過濾備用[19]。進樣前經(jīng)SEP-PAK C18Cartridge預(yù)處理柱處理后進樣。

1.3.3 啤酒中有機酸含量的分析檢測

采用反相高效液相色譜分析啤酒中有機酸含量，其色譜條件如下：LiChrospher 100 RP-18反相色譜柱（5 μm，250 mm×4 mm）；流動相為0.1 mol/L KH2PO4水溶液（用磷酸調(diào)pH 值至3.0）；二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；紫外波長215 nm、帶寬16 nm，參比波長360 nm、帶寬50nm；流速0.6mL/min；進樣量5μL；柱溫25℃。定性定量方法：同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時間一致，通過保留時間與對照品比對定性。同一物質(zhì)的濃度與峰面積成正比例關(guān)系，所以根據(jù)對照品的濃度和峰面積，可以定量得出樣品的濃度。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗

以某品牌10°啤酒為有機酸重復(fù)性試驗的檢測樣品。對同一樣品平行取5份按1.3.3色譜條件進行精密度試驗。分別計算9種有機酸測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）加標回收率試驗

以某品牌10°啤酒為酒基，分別加入一定量不同濃度的有機酸標準系列溶液，按1.3.3色譜條件進行加標回收率的測定。加標量分別為：草酸29.4 mg/L、乳酸95.28 mg/L、酒石酸37.31 mg/L、乙酸92.40 mg/L、蘋果酸90.36 mg/L、α-酮戊二酸3.00 mg/L、抗壞血酸23.88 mg/L、檸檬酸95.76 mg/L、琥珀酸120.12 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸混合標樣反相高效液相色譜分析

9種有機酸混合標樣RP-HPLC分析色譜圖見圖1。

圖1 9種有機酸混合標樣反相高效液色譜分析色譜圖Fig.1 Chromatogram of 9 organic acids mixed standard samples analyzed by reversed-phase high performance liquid chromatography

由圖1可知，9種有機酸分離效果良好，草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的出峰時間分別為3.369 min、3.731 min、4.876 min、5.376 min、5.894 min、6.267 min、7.267 min、7.916 min、11.760 min。

2.2 反相高效液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

一元有機酸（如甲酸、乙酸等）因其羧基中羰基氧和羥基氧上孤對電子的共軛作用[16]，吸收帶主要分布在波長205～215 nm范圍內(nèi)；二元有機酸（如草酸、琥珀酸等）以及多元有機酸（如蘋果酸、檸檬酸等），這兩類有機酸中大部分的有機酸在波長210 nm處有吸收[4，21]。由于啤酒中的有機酸組成復(fù)雜、種類較多，為兼顧各有機酸的分布，確定采用215 nm波長檢測有機酸組分。

2.2.2 流動相緩沖溶液的種類及濃度的選擇

磷酸鹽溶液的緩沖能力直接影響溶液的離子強度以及酸在流動相中的存在形式，從而影響RP-HPLC的分離效果。因此選擇恰當濃度的磷酸鹽緩沖溶液尤為重要[21]。采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）進行有機酸分析時，由于有機酸具有較大的極性，常用的流動相主要成分為水，因此弱酸解離現(xiàn)象易導(dǎo)致不能保留在固定相上。為了使有機酸不出現(xiàn)解離現(xiàn)象，通常流動相選擇偏酸性，從而達到抑制有機酸解離的目的[5]。常用的酸性緩沖溶液如醋酸-醋酸鈉緩沖液、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）等在波長210 nm有較強吸收，由于本底值過高會降低檢測的靈敏度，從而影響檢測結(jié)果的準確性[19]。磷酸鹽緩沖溶液由于吸收波長＜200 nm，特別是KH2PO4緩沖溶液作為測定有機酸組成的流動相效果最好。由于緩沖液濃度過高容易析出，對色譜柱產(chǎn)生損害，同時可能對流動相的背景吸收產(chǎn)生影響，使靈敏度減弱，因此，選擇流動相為濃度0.10 mol/L的KH2PO4緩沖液[4，21]。

2.2.3 流動相緩沖溶液pH值的選擇

酸度系數(shù)又名酸離解常數(shù)（代號Ka值），是指一個特定的平衡常數(shù)，以代表一種酸離解氫離子的能力。由于在不同的酸這個常數(shù)會有所不同，所以酸度系數(shù)會以常用對數(shù)的加法逆元，以符號pKa來表示。一般來說，較大的pKa值（或較小的pKa值）代表較強的酸，這是由于在同一的濃度下，離解的能力較強。本研究的9種有機酸因其解離常數(shù)（pKa值）跨度范圍較大（1.20～5.70）[21]，增加了色譜分離的難度。通過研究流動相緩沖溶液pH值對分離效果影響，確定緩沖溶液pH值，從而達到準確定量9種有機酸的目的。依據(jù)各種有機酸的pKa，配制0.1 mol/L KH2PO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值分別為2.1、2.5、3.0，在柱溫25 ℃、流速0.5 mL/min時，考察不同的流動相pH值對有機酸分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 流動相緩沖溶液pH值對9種有機酸分離效果的影響Fig.2 Effect of pH value of mobile phase buffer on separation effect of 9 organic acids

由圖2可知，隨著流動相pH值增加，各種有機酸的保留時間均有不同程度的減少，從而降低分離效果。當pH值為2.1時，雖然分離效果較為理想，但較低的pH值會降低物質(zhì)響應(yīng)值，對色譜柱的損害較大，嚴重時可能引起硅烷化鍵合相降解；當pH值為2.5時，酒石酸和蘋果酸未能分開。這是由于有機酸的解離程度隨著pH值的增加而增大，從而使其與ODS柱表面烷基作用減弱；當pH值為3.0時，分離效果理想。因此，選擇流動相的pH值為3.0。

2.2.4 流速對分離效果的影響

分別采用流速0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min進行9種有機酸分離效果試驗，考察不同流速對有機酸分離效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 流速對9種有機酸分離效果的影響Fig.3 Effect of flow rate on separation effect of 9 organic acids

由圖3可知，流動相的流速對有機酸的分離效果有一定的影響，隨著流速的增加，保留時間縮短，柱壓隨之增大，分離度降低。由于啤酒樣品中的成分較為復(fù)雜，綜合考慮保留時間與分離度，當流速為0.6 mL/min時分離效果最佳。因此，流動相的流速選擇為0.6 mL/min。

2.3 標準曲線線性方程，線性范圍，相關(guān)系數(shù)，檢出限及定量限

9種有機酸的保留時間、標準曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限見表1。以信噪比（S/N）=3計算檢出限（limit of detection，LOD），以S/N=10計算定量限（limit of quantitation，LQD）。由表1可知，9種有機酸在質(zhì)量濃度0.2～400.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.992～0.999之間，表明有機酸的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，可滿足準確定量的要求。9種有機酸的檢出限（LOD）為0.02～0.33 mg/L，定量限（LQD）0.05～1.0 mg/L。

表1 9種有機酸標準品的保留時間、標準曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限Table 1 Retention time,regression equation of standard curve,correlation coefficient,linear range,detection limit and quantification limit of 9 organic acids standard samples

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

以某品牌10°啤酒為有機酸重復(fù)性試驗的檢測樣品。對同一樣品平行取5份進行精密度試驗。

表2 9種有機酸精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of precision tests of 9 organic acids mg/L

結(jié)果如表3所示，方法精密度試驗結(jié)果相對標準偏差（RSD）為0.3%～11.5%，除α-酮戊二酸的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為7.6%外，其他幾種有機酸的變異系數(shù)（CV）均≤5.1%。說明該方法精密度較高。

2.4.2 加標回收率試驗

以某品牌10°啤酒為酒基，分別加入一定量不同濃度的有機酸標準系列溶液，進行加標回收率的測定。加標回收率試驗結(jié)果見表3。

由表3可知，在啤酒樣品中，除草酸和抗壞血酸的回收率稍低外，其他有機酸的回收率均在90%～110%的范圍內(nèi)，加標回收率結(jié)果RSD為0.3%～11.5%。草酸的回收率稍低主要是由于啤酒中的脫氫抗壞血酸與草酸發(fā)生可逆反應(yīng)，引起草酸含量降低[22-23]?？箟难岬幕厥章噬缘偷闹饕蚴怯善【浦羞@種成分含量甚微。

表3 9種有機酸分析的加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery rate tests of 9 organic acids

2.5 啤酒釀造過程中有機酸含量的動態(tài)分析

2.5.1 啤酒釀造過程中有機酸總量動態(tài)分析

啤酒中有機酸的組成、含量與啤酒的感官評價密切相關(guān)。作為啤酒風(fēng)味物質(zhì)之一，有機酸在麥汁中的含量多少主要取決于麥芽等主料，酒花、大米等對有機酸含量影響甚微[7]。麥汁中的可發(fā)酵性糖作為酵母的碳源，小分子的氮作為酵母的氮源，啤酒酵母充分利用進行生理代謝，有機酸的含量變化同時也受酵母的種類、性能以及發(fā)酵工藝的影響。麥汁中糖類含量約占90%，除了部分多糖以外，均能夠通過糖酵解途徑（glycolytic pathway，EMP）進入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）或無氧酵解[23-24]。啤酒釀造過程中有機酸總量動態(tài)分析結(jié)果見圖4。

圖4 啤酒釀造過程中有機酸總量動態(tài)分析Fig.4 Dynamic analysis of total organic acids contents in beer brewing process

由圖4可知，啤酒釀造過程中有機酸總量隨著發(fā)酵時間（0～10 d）的延長呈現(xiàn)先增長后平穩(wěn)的趨勢，特別是在發(fā)酵初期（發(fā)酵前2 d），隨著啤酒酵母的大量繁殖，有機酸含量增幅最大，在發(fā)酵2～10 d內(nèi)，有機酸含量平穩(wěn)增長，在發(fā)酵第6天左右，有機酸總含量趨于平衡，有機酸總量約為450 mg/L，此時發(fā)酵基本結(jié)束，進入后發(fā)酵階段。發(fā)酵過程中的有機酸總量的變化趨勢與發(fā)酵度先快速增長后平穩(wěn)的趨勢基本一致。

2.5.2 啤酒釀造過程中乙酸、琥珀酸、蘋果酸含量的動態(tài)分析

由圖5可知，乙酸、琥珀酸、蘋果酸含量的變化與有機酸總量的變化規(guī)律相似。在釀造過程中，乙酸含量變化為先快速增加后穩(wěn)定，與發(fā)酵度變化規(guī)律保持一致。由于發(fā)酵初期麥汁中含氧，乙醛和乙醇氧化形成了大量乙酸，此外酵母代謝過程中利用丙酮酸后也產(chǎn)生了部分乙酸[5]。在此期間，琥珀酸含量先大幅增長后平緩，琥珀酸含量增至130 mg/L左右，由于釀造過程中三羧酸循環(huán)使酵母產(chǎn)生了大量的琥珀酸，因此，琥珀酸在啤酒成品中有機酸總量中占有較大的比重，約占54%；蘋果酸在整個發(fā)酵過程中呈平穩(wěn)增長的趨勢，增長至45.2 mg/L；蘋果酸為丙酮酸脫羧后的中間代謝產(chǎn)物，大部分蘋果酸分泌于細胞外無法回收細胞內(nèi)[25]。因此，蘋果酸含量的變化趨勢較為平穩(wěn)。

圖5 啤酒釀造過程中乙酸、琥珀酸、蘋果酸含量的動態(tài)分析Fig.5 Dynamic analysis of acetic acid,succinic acid and malic acid contents in beer brewing process

2.5.3 啤酒釀造過程中草酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸含量的動態(tài)分析

由圖6可知，在啤酒釀造過程中，草酸、酒石酸含量的變化不大，處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；檸檬酸含量增長幅度相對平緩，特別是后發(fā)酵期間含量變化較??；乳酸含量一直增加，與發(fā)酵程度保持一致。乳酸主要產(chǎn)生于發(fā)酵后期，酵母對丙酮酸利用發(fā)生歧化反應(yīng)得到乳酸；草酸主要來源于麥汁，其含量隨麥芽用量的增加而增加，發(fā)酵過程中草酸含量波動不大，當原料麥芽中草酸濃度過高時，可能會與釀造水中的鈣離子形成草酸鈣，引起啤酒的非生物性渾濁。因此加強對原料年份和品種的控制，應(yīng)盡可能監(jiān)測麥芽中的草酸含量，選擇含量相對較低的麥芽作為原料[6]；檸檬酸為TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物，也是在啤酒中含量較高的有機酸，高含量的檸檬酸可能是啤酒感官分析中酸味的主要來源之一；酒石酸是酵母代謝過程中的產(chǎn)物，被分泌于細胞外，含量相對較少，在發(fā)酵初期一經(jīng)形成便趨于穩(wěn)定。

圖6 啤酒釀造過程中草酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸含量的動態(tài)分析Fig.6 Dynamic analysis of oxalic acid,lactic acid,citric acid and tartaric acid contents in beer brewing process

2.5.4 啤酒釀造過程中α-酮戊二酸、抗壞血酸含量的動態(tài)分析

α-酮戊二酸、抗壞血酸含量兩種有機酸在啤酒中含量較低。由圖7可知，在釀造過程中，α-酮戊二酸含量在主發(fā)酵階段大幅提升，進入后發(fā)酵階段含量趨于平穩(wěn)，而抗壞血酸含量變化保持相對穩(wěn)定。α-酮戊二酸含量低的原因是酵母從有氧呼吸轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵后，α-酮戊二酸脫氫酶合成受阻，因此影響了α-酮戊二酸的形成[24-25]；而抗壞血酸主要來源于酒花，在釀造過程中并不會形成更多的抗壞血酸，因此抗壞血酸含量保持相對穩(wěn)定。

圖7 啤酒釀造過程中α-酮戊二酸、抗壞血酸含量的動態(tài)分析Fig.7 Dynamic analysis of α-ketoglutaric acid and ascorbic acid contents in beer brewing process

3 結(jié)論

本實驗對啤酒中有機酸的反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化色譜條件為檢測波長215 nm、流動相緩沖液濃度0.10 mol/L KH2PO4、pH值3.0、流速0.6 mL/min，該方法可實現(xiàn)啤酒中9種有機酸一次性分離（草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸）。該檢測方法精密度高，重復(fù)性及準確性良好，操作簡便、快速，可用于啤酒中有機酸含量定量分析。在啤酒釀造過程中，乙酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、α-酮戊二酸含量的變化與有機酸總量的變化規(guī)律相似，均呈現(xiàn)先增長后平穩(wěn)的趨勢。草酸、抗壞血酸、酒石酸含量變化相對平穩(wěn)。啤酒中的有機酸含量與啤酒感官評價密切相關(guān)。在啤酒釀造過程中有機酸的含量變化，主要源于啤酒酵母對麥汁中各種可發(fā)酵性糖的利用。對釀造過程中各種有機酸進行動態(tài)分析，了解啤酒釀造過程中有機酸含量的變化規(guī)律，為最終改善啤酒過酸的現(xiàn)象和改進釀造工藝提供了依據(jù)。