胡盼盼

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

肝臟可以通過體內(nèi)酶的新陳代謝對酒精進行生物轉(zhuǎn)化[1]，并通過將酒精排出體外進行解毒，但酒精濫用則可導(dǎo)致肝臟嚴重的病理改變，引發(fā)嚴重的肝臟疾病，酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）已經(jīng)成為威脅人類健康的重要原因[2]，對個人和社會造成了不良的影響[3]。ALD可從酒精性肝損傷開始，發(fā)展為酒精性肝炎或脂肪變性[4]，并進一步發(fā)展為肝纖維化或肝硬化[5]，甚至最終導(dǎo)致肝癌。細胞損傷、炎癥、氧化應(yīng)激等是酒精誘導(dǎo)肝損傷的主要因素[6]，目前針對ALD的治療手段有限且藥物治療具有明顯副作用[7]，針對微生物或天然物質(zhì)具有較強的抗氧化活性，因此開發(fā)保肝護肝的功能食品具有重要意義。

益生菌是有益于人體健康的微生物[8]，具有抗菌、抗癌、抗氧化和抗過敏作用、降低血脂、增強免疫功能[9]，并具有菌株依賴性。乳酸桿菌和雙歧桿菌是應(yīng)用最廣泛的益生菌。乳酸菌為革蘭氏陽性菌[10]，廣泛分布于自然界。近年來，一些菌株被發(fā)現(xiàn)還具有其他重要的生物學(xué)功能，如抗衰老和抗氧化活性等[10]。實驗室前期從新疆馬奶酒中自行篩選分離鑒定得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L，該菌株具有良好的發(fā)酵性能及生物活性，并且已經(jīng)驗證其菌體[11]、胞外多糖[12]、發(fā)酵液等具有免疫和抗腫瘤等功能。因此，本研究構(gòu)建酒精慢性肝損傷小鼠模型，研究副干酪乳桿菌M5L對小鼠生長性能和肝功能的影響，對深入開發(fā)乳酸菌保肝功能食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及動物

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisupsp.paracasei）M5L：分離自新疆馬奶酒中，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系保藏[13]。

雄性昆明小鼠（體質(zhì)量25～28 g）：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證號SCXK（滬）2017-0011），飼養(yǎng)溫度為（21±1）℃，相對濕度為（60±5）%，光照12 h/d。實驗室通風(fēng)良好，小鼠自由攝食及飲水。

1.1.2 試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒：南京建成生物工程公司；白酒（酒精度56%vol）：汾酒集團有限責(zé)任公司；無水乙醇、二甲苯（均為分析純）：天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Eon型酶標儀：美國BioTek公司；BSA224S型電子稱：廣東省精密儀器公司；MultiModeⅢa型顯微鏡：美國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與給藥

小鼠先進行5 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，每組10只，隨機分成四組：分別為對照組（CON組）、模型組（MOD組）、低劑量副干酪乳桿菌M5L處理組（107CFU/mL，L-M5組）、高劑量副干酪乳桿菌M5L處理組（108CFU/mL，H-M5組）。

副干酪乳桿菌處理組小鼠按0.15 mL/10 g的劑量灌胃副干酪乳桿菌液，對照組、模型組小鼠灌胃給予等體積蒸餾水，處理2 h后對照組給予蒸餾水，其他各組按0.15 mL/10 g劑量灌胃白酒（酒精度56%vol），每天1次，連續(xù)28 d。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量的變化

小鼠飼養(yǎng)28 d后，分別記錄初始和結(jié)束后小鼠的體質(zhì)量，計算體質(zhì)量增長率，其計算公式如下：

1.3.3 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的變化

小鼠飼養(yǎng)28 d后，稱體質(zhì)量，頸椎脫臼處死取出脾臟和胸腺，分別稱質(zhì)量，并計算相應(yīng)的臟器指數(shù)，其計算公式如下：

1.3.4 小鼠肝臟的病理變化

肝臟形態(tài)的變化：小鼠飼養(yǎng)28 d后，頸椎脫臼處死，取出小鼠肝臟，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色[14]，顯微鏡下觀察小鼠肝臟的病理變化。

肝功能的變化：小鼠飼養(yǎng)28 d后，頸椎脫臼處死，取出肝組織稱質(zhì)量，加入9倍質(zhì)量的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，3 500 r/min離心20 min，取上清液，采用試劑盒測定小鼠血清中ALT、AST的含量和肝臟中GSH、SOD、MDA的含量。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0.1統(tǒng)計軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并作圖，不同字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響

由表1可知，與對照組相比，模型組、副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠體質(zhì)量增長率均顯著降低（P＜0.05），但與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠體質(zhì)量增長率明顯升高（P＜0.05），由此說明副干酪乳桿菌M5L能夠促進小鼠的生長，這可能是由于副干酪乳桿菌M5L具有保護小鼠腸胃，提高機體性能，從而使小鼠飲食量增加的緣故[8]。

表1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on body weight of mice with alcoholic liver injury

2.2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠免疫系統(tǒng)功能的影響

胸腺和脾臟是機體主要的免疫組織，參與機體細胞免疫和體液免疫，可以有效激活T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞參與免疫反應(yīng)，因此可以根據(jù)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)衡量小鼠的免疫功能[14]。由表2可知，與對照組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著減?。≒＜0.05），說明酒精傷害小鼠免疫組織的發(fā)育。與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠的胸腺指數(shù)均明顯增加（P＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性，菌體濃度越大，胸腺指數(shù)增加越顯著（P＜0.05），且高低劑量差異顯著（P＜0.05）。對于脾臟指數(shù)，低劑量的副干酪乳桿菌處理不能顯著的增大小鼠的脾臟指數(shù)（P＞0.05），但高劑量組則可以顯著的增加小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05），且高低劑量組之間差異顯著（P＜0.05）。由此說明，副干酪乳桿菌M5L能在一定程度上改善酒精致小鼠機體免疫組織的傷害。

表2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠免疫器官的影響Table 2 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on immune organ of mice with alcoholic liver injury

2.3 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

2.3.1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟形態(tài)的影響

由圖1可知，對照組小鼠肝臟未見充血、腫脹和炎癥現(xiàn)象，肝細胞輪廓清晰，排列整齊；模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯充血腫脹的情況，大量肝細胞堆積在一起，細胞形態(tài)嚴重破壞，低劑量副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠雖然還有一定的充血情況，但形態(tài)有所好轉(zhuǎn)，高劑量副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟炎癥顯著減小，無充血，肝細胞形態(tài)也恢復(fù)正常，說明副干酪乳桿菌M5L可以有效的改善小鼠肝臟的病理狀態(tài)。

圖1 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟形態(tài)的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus paracasei M5L on liver morphology of mice with alcoholic liver injury

2.3.2 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶是判斷肝細胞損傷的重要指標之一，位于肝細胞胞漿內(nèi)，當(dāng)細胞損害后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶從細胞流入血液，從而導(dǎo)致谷丙轉(zhuǎn)氨酶在外周血清中濃度的升高[15]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠血清中ALT活性顯著增高（P＜0.05），說明酒精造成肝臟嚴重的傷害。與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠血清中ALT活性顯著降低（P＜0.05）。

谷草轉(zhuǎn)氨酶又名天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)肝臟受到病理性破壞就會釋放到血液中，導(dǎo)致血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量越高，肝臟受損程度越嚴重[9]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠血清中AST活性顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠血清中AST活性均顯著降低（P＜0.05），由此說明副干酪乳桿M5L能改善小鼠肝功能修復(fù)能力。

表3 副干酪乳桿菌M5L對酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響Table 3 Effects of Lactobacillus paracasei M5L on liver function mice with alcoholic liver injury

丙二醛是衡量細胞損傷的重要指標，正常機體中也存在一定含量的MDA，但在脂質(zhì)過氧化過程中大量產(chǎn)生，還會產(chǎn)生一系列的自由基，從而加劇機體損傷[16]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的MDA含量顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的MDA的含量均顯著降低（P＜0.05），說明副干酪乳桿菌M5L可以阻止酒精導(dǎo)致的肝細胞氧化及產(chǎn)生自由基。

機體的氧化平衡需要抗氧化酶的參與，超氧化物歧化酶為活性最強的抗氧化酶。SOD可以清除超氧陰離子自由基，防止脂質(zhì)過氧化，減輕其對細胞的損害，因此含量越高，說明抗氧化能力越強[17]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的SOD活性均顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性，劑量越大，效果越顯著，高低劑量之間存在顯著差異（P＜0.05），且顯著高于對照組（P＜0.05）。由此說明副干酪乳桿菌M5L具有一定的抗氧化能力。

GSH是組織中一種含巰基的三肽，由半膚氨酸、谷氨酸及甘氨酸組成，GSH代謝過程能參與體內(nèi)氧化還原過程，能自由基結(jié)合，防止細胞破壞，同時還可對抗自由基對肝臟的損害[18]。由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟的GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，副干酪乳桿菌M5L處理組小鼠肝臟的GSH含量均顯著增加（P＜0.05），甚至顯著高于對照組（P＜0.05），說明副干酪乳桿菌M5L抗氧化能力較強，可改善小鼠機體性能。

3 討論

乙醇是一種很容易穿過細胞膜的小分子[19]，影響乙醇吸收和代謝的因素很多，包括性別、年齡、種族和體質(zhì)量，低于體積分數(shù)10%的乙醇可以直接被肺、腎和汗液排出。乙醇生物轉(zhuǎn)化的主要代謝途徑是氧化成乙醛，該過程需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的參與，主要通過乙醇脫氫酶實現(xiàn)，乙醇脫氫酶主要存在于肝臟和胃腸道中[20]，過量飲酒即可引發(fā)酒精性肝損傷。KIM N H等[21]給予C57BL/6J小鼠八周酒精處理后發(fā)現(xiàn)，小鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的顯著升高，小鼠肝細胞受到嚴重的破壞，脂肪堆積明顯，此外產(chǎn)生大量的自由基和炎癥因子；LI C等[22]通過給C57BL/6小鼠酒精處理發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟受到嚴重的破壞，大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，模型組小鼠肝臟MDA含量顯著增多，抗氧化酶顯著降低，說明酒精肝損傷的確與氧化失衡相關(guān)。

乳酸菌作為主要的益生菌，具有抗氧化的作用，能夠促進腸道菌群平衡，抑制致病細菌生長，具有生物拮抗作用，其代謝產(chǎn)物參與了機體屏障的構(gòu)建[23]。實驗室前期已經(jīng)對副干酪乳桿菌M5L體外抗氧化能力進行了測定，結(jié)果表明副干酪乳桿菌M5L體外可以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基以及具有較強的還原力，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，且在體內(nèi)能有效的抑制ROS的產(chǎn)生[24]。此外，大量研究表明乳酸菌可以顯著改善酒精導(dǎo)致的肝臟損傷。許女等[25]研究發(fā)現(xiàn)，山西老陳醋植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C181處理，可顯著降低慢性酒精誘導(dǎo)昆明小鼠肝臟中甘油三酯和游離脂肪酸的含量，以及血清中AST和ALT的活性；陸婷等[26]采用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG或MRS培養(yǎng)基將小鼠連續(xù)處理4周后再采用體積分數(shù)50%的乙醇灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒精處理導(dǎo)致小鼠ALT和AST活性顯著升高，脂肪合成相關(guān)基因表達顯著升高，脂肪分解相關(guān)基因表達顯著降低，經(jīng)過鼠李糖桿菌LGG處理后呈現(xiàn)不同程度的逆轉(zhuǎn)，表明鼠李糖桿菌LGG具有保護小鼠急性酒精性肝損傷的作用。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，高低劑量的副干酪乳桿菌M5L干預(yù)能夠顯著改善小鼠的生長性能，并增強小鼠肝臟的抗氧化能力。

4 結(jié)論

本研究通過建立酒精性肝損傷小鼠模型，研究了副干酪乳桿菌M5L對小鼠生長性能和肝功能的影響。結(jié)果表明，與模型組小鼠相比，副干酪乳桿菌M5L處理后能顯著提高小鼠的體質(zhì)量（P＜0.05），顯著增大胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P＜0.05）；減輕小鼠肝臟水腫、充血，肝細胞壞死的情況，并且顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性（P＜0.05），顯著降低小鼠肝臟中丙二醛（MDA）的含量（P＜0.05），顯著增加小鼠肝臟中超氧化歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）的含量（P＜0.05）。綜上，副干酪乳桿菌能夠提高酒精致肝損傷小鼠的生長性能，并增強小鼠肝臟的抗氧化能力，對乳酸菌作為保肝護肝功能食品的開發(fā)具有重要意義。