黃桂瓊 陳 洪 袁維蔚 姚志強 占嬈娜 楊荃懷

廣州中醫(yī)藥大學惠州醫(yī)院 廣東惠州 516001

慢性咳嗽是造成社區(qū)重大疾病負擔的原因之一，流行病學調(diào)查表明，咳嗽是社區(qū)的常見癥狀，全球成人發(fā)病率為9.6%[1]。在我國，慢性咳嗽是患者尋求呼吸?？圃u估的最常見原因，咳嗽是初級保健咨詢期間報告的最常見癥狀[2]。龍脷葉(Sauropus spatulifolius Beille)是大戟科守宮木屬(Sauropus)植物，氣微，味淡、微甘，具“潤肺止咳，化痰定喘”的功效，常用于治療急性咽喉炎、支氣管炎、支氣管哮喘、肺結(jié)核等呼吸道疾病[3]。龍脷葉作為廣東地道藥材，其良好的止咳化痰作用已得到臨床實踐證實。本項目對龍脷葉的止咳、祛痰、抗炎作用進行實驗研究。

1 方法

1.1 實驗藥物試劑

本實驗所用的龍脷葉為我院中藥房藥用龍脷葉，由廣州致信藥業(yè)有限公司提供；氨水購于廣州市化學試劑廠，酚紅購自天津光復精細化工研究所。

1.2 龍脷葉乙醇提取物制備

取干燥的龍脷葉粉碎成粗粉，置多功能提取罐中，用 90%乙醇加熱回流提取，過濾，合并濾液，回收乙醇，干燥，得總浸膏。

1.3 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠及SPF級雄性SD大鼠購買于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0041。飼養(yǎng)在SPF級別IVC系統(tǒng)中，12H晝夜交替，室溫控制在25 ℃，濕度40%～60%。

1.4 鼠氨水引咳模型

將昆明小鼠放入1 000 mL的大燒杯并罩住燒杯口，用超聲噴霧器以中檔風速向燒杯中通入200 mL/L氨水，噴霧15 s后關閉，觀察并記錄1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)(以腹肌收縮，同時張大嘴呼吸為小鼠咳嗽1 次)，以咳嗽次數(shù)為3～6次小鼠作為初篩合格小鼠進行實驗。將小鼠分為：模型組(等體積溶劑)，龍脷葉低劑量組(3 g生藥/kg)、龍脷葉中劑量組(6 g生藥/kg)、龍脷葉高劑量組(12 g生藥/kg)、陽性對照組(孟魯司特鈉，2 mg/kg)，10只每組。連續(xù)給藥5天，末次給藥30 min后，將小鼠放于大燒杯內(nèi)，用氨氣引咳15 s，以腹肌收縮、同時張嘴作為小鼠咳嗽的指標，同時觀察小鼠咳嗽潛伏期以及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5 小鼠氣管排泌酚紅實驗

末次給藥30 min 后，小鼠經(jīng)腹腔注射5% 酚紅溶液0.1 mL/10 g，0.5 h 之后處死動物，剪取相同一段氣管。放進裝有2 mL生理鹽水的試管中，同時加入0.1 mL的1 M氫氧化鈉溶液，置于波長546 nm處，測吸光度值，檢測酚紅含量。

1.6 大鼠急性肺損傷模型

SD大鼠分為對照組(等體積溶劑)，模型組(等體積溶劑)，龍脷葉低劑量組(2.25 g生藥/kg)、龍脷葉中劑量組(4.5 g生藥/kg)、龍脷葉高劑量組(9g生藥/kg)、陽性對照組(孟魯司特鈉，1.5 mg/kg)，10只每組。大鼠腹腔注射LPS(2.5 mg/kg)制作大鼠急性肺損傷模型。造模后24 h麻醉后處死大鼠。

1.7 Elisa檢測TNF-α、IL-1β含量

處死大鼠，打開胸腔，結(jié)扎右側(cè)肺部，近頭端氣管位置，將預冷PBS緩慢注入大鼠左側(cè)肺泡內(nèi)，然后緩慢抽出，重復3次，將收集的肺泡灌洗液離心取上清，-80 ℃保存。按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 龍脷葉乙醇提取物對氨水致小鼠咳嗽的影響

龍脷葉乙醇提取物對濃氨水致小鼠咳嗽實驗結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，龍脷葉乙醇提取物低、中、高劑量組小鼠咳嗽潛伏期均延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。龍脷葉乙醇提取物低劑量組的咳嗽潛伏期小于陽性對照組，與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。龍脷葉乙醇提取物中、高劑量組咳嗽潛伏時間與陽性對照組相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比，龍脷葉乙醇提取物低、中、高劑量組能顯著減少2 min 內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；龍脷葉乙醇提取物高劑量組的2 min 內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)與陽性對照組相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。龍脷葉乙醇提取物中、低劑量組的2 min 內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)大于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：咳嗽潛伏時間；B：咳嗽次數(shù)；*P<0.05與對照組比較，# P<0.05；與陽性對照組比較

2.2 龍脷葉乙醇提取物對小鼠酚紅排泌量的影響

酚紅排泌量實驗結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，龍脷葉乙醇提取物的酚紅排泌量增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。龍脷葉乙醇提取物低劑量組的酚紅排泌量小于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。龍脷葉乙醇提取物中、高劑量組的酚紅排泌量與陽性對照組相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

*P<0.05與對照組比較，# P<0.05；與陽性對照組比較

2.3 龍脷葉乙醇提取物對TNF-α、IL-1β含量的影響

促炎因子TNF-α和IL-1β對于炎性反應的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響。龍脷葉乙醇提取物TNF-α、IL-1β表達的影響如圖3所示。與對照組比較，模型組大鼠TNF-α，IL-1β含量均明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，龍脷葉乙醇提取物劑量依賴性的抑制大鼠TNF-α，IL-1β的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。龍脷葉中、高劑量組的TNF-α，IL-1β的表達水平與陽性對照組相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。龍脷葉低劑量組的TNF-α，IL-1β的表達水平高于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

咳嗽是臨床常見癥狀，由內(nèi)源性或外源性刺激物刺激呼吸道黏膜，造成神經(jīng)肽的釋放，刺激感受器引起神經(jīng)沖動，刺激咳嗽中樞，大腦皮質(zhì)控制性失衡而產(chǎn)生[4]。慢性咳嗽是我國常見的健康問題，隨著工業(yè)化和城市化進程的加快，慢性咳嗽的患病率仍在逐漸上升。呼吸道感染是引起咳嗽與咳痰的最常見病因，此外，環(huán)境和職業(yè)暴露、吸煙以及不健康的生活方式也會引起慢性咳嗽[5]。盡管咳嗽是機體一種重要的防御反射，可清除呼吸道異物，但頻繁劇烈或長時間的咳嗽會給患者工作、生活帶來嚴重影響[6]。正常支氣管黏膜分泌少量黏液，使呼吸道黏膜保持濕潤。當呼吸道發(fā)生炎癥時，黏膜分泌增多，毛細血管壁通透性增加。炎性滲出物與黏液、吸入的塵埃及組織壞死物等混合而成痰液，隨咳嗽動作排出體外[7]。

A：TNF-α含量；B：IL-1β含量；*P<0.05與對照組比較，# P<0.05；與陽性對照組比較

咳嗽治療主要分為對因治療與對癥治療[8]。對應治療主要是對咳嗽的原發(fā)病進行針對性治療，如急性上呼吸道感染、變異性哮喘、胃食管反流等。然而臨床上部分患者的咳嗽并沒有明顯誘因，只能進行對癥治療。目前的鎮(zhèn)咳藥主要分為以可待因、嗎啡為代表的中樞性鎮(zhèn)咳藥，通過直接抑制延髓咳嗽中樞而產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用；以那可丁、苯丙哌林為代表的外周性鎮(zhèn)咳藥，通過抑制咳嗽發(fā)射弧中的感受器、傳入神經(jīng)、傳出神經(jīng)中的某個環(huán)節(jié)而產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用。盡管這些藥物在咳嗽的對癥治療中有效，但是藥物依賴性等副作用限制了它們的長期應用[9]。

龍脷葉是廣東傳統(tǒng)道地藥材，臨床研究表明，以龍脷葉為主藥的方劑，如千龍湯可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病[10]，嶺南醫(yī)家劉小虹自擬的三葉湯(龍脷葉+人參葉+枇杷葉)在治療咳嗽、咽癢具有良好的臨床療效[11]；現(xiàn)代藥理研究亦同時表明，龍脷葉具有抗炎作用[12-13]；藥理學分析發(fā)現(xiàn)合金歡基丙酮和黃酮苷等有效成分可能是龍脷葉化痰止咳作用的物質(zhì)基礎[14]。本研究采用霧化吸入氨水咳嗽模型，探索不同劑量龍脷葉乙醇提取物對氨水誘導咳嗽的影響，結(jié)果顯示龍脷葉具有止咳和祛痰的作用。在多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中，炎癥細胞大量浸潤，常常伴有大量的炎性介質(zhì)因子[15]。肺泡巨噬細胞受到脂多糖等內(nèi)源性刺激后，會首先誘導TNF-α的產(chǎn)生，TNF-α可以進而誘導IL-1β的釋放，這些炎癥因子參與引發(fā)炎癥的級聯(lián)反應，誘導炎性細胞浸潤，加速肺損傷病理改變[16-17]，故監(jiān)測這些促炎因子是評價藥物是否緩解肺部炎癥反應的常用手段。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)龍脷葉能夠降低TNF-α與IL-1β的表達水平，提示龍脷葉具有抗炎作用，這與既往研究的結(jié)果一致[12,18]。本研究比較龍脷葉與陽性對照孟魯司特鈉的差異。孟魯司特鈉是一種口服的白三烯受體拮抗劑，能特異性抑制氣道中的半胱氨酰白三烯(CysLT1)受體，從而達到改善氣道炎癥，有效控制咳喘癥狀[19]。我們發(fā)現(xiàn)龍脷葉高劑量組與陽性對照的作用相近。這些結(jié)果提示龍脷葉具有止咳、祛痰、抗炎的作用，然而其作用機制還有待進一步深入研究。