李 璋，許 晅，孟 迎，馬群飛，Huma Farooque Hashmi，張鵬英，陳靠山，

山東大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院，2國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 青島266237

本實(shí)驗(yàn)室前期從黑根霉（Rhizopus nigricans）的發(fā)酵液中分離得到胞外多糖，對(duì)其生物活性和結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了深入研究［1,2］。黑根霉胞外多糖可以誘導(dǎo)HCT-116、CT26、BGC-823等多種腫瘤細(xì)胞凋亡［3］，增強(qiáng)正常小鼠和免疫低下小鼠的免疫活性［4］，抑制氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌［5］，抑制甲基硝基亞硝基胍（MNNG）誘導(dǎo)的小鼠慢性萎縮性胃炎［6］。

目前，黑根霉胞外多糖的研究集中在其藥理活性，Song等［5］通過胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤模型研究了黑根霉胞外多糖的抗腫瘤活性，并對(duì)其發(fā)揮抗腫瘤活性的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但是相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)黑根霉胞外多糖生物活性的影響尚無文獻(xiàn)報(bào)道。分子結(jié)構(gòu)是多糖發(fā)揮其生物活性的基礎(chǔ)，研究不同結(jié)構(gòu)的黑根霉胞外多糖對(duì)提高其生物活性至關(guān)重要。多糖的相對(duì)分子質(zhì)量是影響其生物活性的重要參數(shù)，高相對(duì)分子質(zhì)量多糖的分子體積較大，不利于跨膜進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性［7］；低相對(duì)分子質(zhì)量多糖更容易結(jié)合活性位點(diǎn)，但無法形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)［8］。因此，通過研究不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖的生物活性可以找出活性較好的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，對(duì)將來進(jìn)一步研究黑根霉胞外多糖的構(gòu)效關(guān)系和藥理活性的開發(fā)具有重大意義。

分離不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖的方法有物理法、化學(xué)法和酶解法，均存在工藝復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)，分級(jí)醇沉法工藝簡單且實(shí)驗(yàn)周期較短，因此本研究采用分級(jí)醇沉法分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖。多糖隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增大，極性逐漸減小，結(jié)合水分子的能力減弱，利用不同濃度的乙醇改變?nèi)芤旱臉O性，可以使不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖組分得到沉淀［7］。本研究通過分級(jí)醇沉從黑根霉的發(fā)酵液中得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖，通過測(cè)定不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除活性來尋找具有高抗氧化活性組分對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，測(cè)定其對(duì)MFC和A549細(xì)胞增殖的抑制活性和誘導(dǎo)凋亡活性來尋找具有顯著抗腫瘤活性的多糖組分所對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，檢測(cè)其對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖和一氧化氮釋放量的影響來篩選具有顯著免疫調(diào)節(jié)活性的多糖組分。本研究為黑根霉胞外多糖的藥效學(xué)研究提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步將黑根霉胞外多糖開發(fā)為抗腫瘤藥物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑根霉菌種保存于山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，MFC細(xì)胞、A549細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），D301-R大孔吸附樹脂（北京索萊寶科技有限公司），葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）（Sigma-Aldrich），抗壞血酸、1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH自由基）、透析袋（上海源葉生物科技有限公司），胎牛血清、高糖型DMEM培養(yǎng)基（Gibco），ABTS自由基測(cè)試試劑盒、羥自由基測(cè)試試劑盒（南京建成生物研究所），CCK-8、一氧化氮檢測(cè)試劑盒、Annexin VFITC細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 黑根霉的培養(yǎng)與發(fā)酵 黑根霉（Rhizopus

nigricans）接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行二次活化，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。挑取邊緣菌絲接入裝有500 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中，在28 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d進(jìn)行發(fā)酵。搖瓶發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物與馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基以1∶20的比例裝入100 L發(fā)酵罐，總體積不超過70 L，發(fā)酵時(shí)間為3 d。設(shè)定發(fā)酵溫度28±1 ℃，通氣量50 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min，罐壓維持0.03～0.05 Mpa。

1.2.2 黑根霉胞外多糖的制備 8層紗布過濾后收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至原體積的1/3，使用木瓜蛋白酶聯(lián)合Sevage（氯仿：正丁醇=3∶1）脫蛋白，減壓濃縮去除有機(jī)試劑后，上清液經(jīng)D301-R大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色，收集洗脫液并減壓濃縮至適當(dāng)體積。分次加入一定體積無水乙醇使乙醇終濃度分別為60%、70%和80%，并分別在4 ℃冰箱靜置過夜，收集3種乙醇濃度下的沉淀，復(fù)溶后8000 r/min離心20 min后收集沉淀，加蒸餾水充分溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 mL［9］。將溶液分別置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為1000 D的透析袋中在4 ℃冰箱中透析48 h，冷凍干燥3 d得到RPS-1、RPS-2和RPS-3。

1.2.3 黑根霉胞外多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 高效凝膠過濾色譜（HPSEC）檢測(cè)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量和多分散指數(shù)。色譜條件如下：色譜柱：TSKgel G3000PWXL，以超純水為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速為0.6 mL/min，柱溫控制在30 ℃，每次進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器（RID）。以已知相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品［重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）分別為1000，2500，5000，7500，10 000，50 000 D］作lgMw-RT 校正曲線：y=-0.224x+13.402，R2=0.9922。精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，樣品配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣小瓶中。

1.2.4 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)參考Zhang［10］的方法并進(jìn)行改進(jìn)，精密稱定10 mg DPPH置于100 mL容量瓶中，用75%乙醇定容至100 mL刻度線后避光保存?zhèn)溆?。取不同質(zhì)量濃度的黑根霉胞外多糖溶液250 μL于試管中，分別加入DPPH溶液1.25 mL。振蕩混勻后避光放置30 min，在515 nm波長處測(cè)定吸光值。以Vc為陽性對(duì)照，以等體積超純水代替多糖樣品溶液測(cè)定空白對(duì)照組吸光值，以等體積75%乙醇代替DPPH溶液測(cè)定樣品本底吸光度值（A）。DPPH自由基清除率（%）=1-［(As-A0）/Ac］×100，As為樣品組吸光值，A0為樣品本底吸光值，Ac為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.5 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力測(cè)定 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液與

7 mmol/L ABTS溶液，按1∶1比例混合，室溫避光靜置反應(yīng)16 h，無水乙醇稀釋ABTS儲(chǔ)備液使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.05，作為ABTS工作液。取1 mL樣品和6 mL ABTS工作溶液，室溫條件下充分混合反應(yīng)6 min［11］，于734 nm 波長下測(cè)吸光度，記為As。1 mL蒸餾水代替樣品溶液測(cè)得的吸光值為Ac，6 mL蒸餾水代替ABTS工作液，其吸光值記為A0。Vc作陽性對(duì)照。ABTS自由基清除率（%）=1-［(As-A0）/Ac］×100。

1.2.6 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除能力測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用南京建成生物研究所的羥基自由基檢測(cè)試劑盒測(cè)定黑根霉胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除活力，樣品溶液配制同1.3.5。以等體積超純水代替樣品溶液測(cè)定空白對(duì)照組吸光值，以等體積超純水代替工作液測(cè)定樣品本底吸光值。羥基自由基清除率（%）=1-［(As-A0）/Ac］×100%，As為樣品組吸光值，A0樣品本底吸光值，Ac為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.7 黑根霉胞外多糖對(duì)小鼠前胃癌MFC細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期MFC細(xì)胞和A549細(xì)胞接種于96孔板中，每孔6000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)48 h后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，2 h后在450 nm波長處測(cè)定吸光值，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.8 黑根霉胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3000個(gè)細(xì)胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后加藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，2 h后測(cè)定吸光值A(chǔ)450nm，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.9 黑根霉胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7一氧化氮釋放量的影響 取對(duì)數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞，5000/孔接種于96孔板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后加藥，將細(xì)胞分為對(duì)照組、脂多糖（LPS）組（1 μg/mL）和RPS-1、RPS-2、RPS-3給藥組（0.8 mg/mL），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加藥后放置在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。根據(jù)NO檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞上清液中的NO含量進(jìn)行檢測(cè)，另取一塊96孔板，小心吸取細(xì)胞上清液50 μL置于其中，每孔依次加入Griess I試劑和GriessⅡ試劑50 μL并混勻。室溫放置15 min后，在540 nm波長處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量［12］。

1.2.10 黑根霉胞外多糖對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后吸棄培養(yǎng)基，其中3個(gè)孔各加2 mL完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，其余3個(gè)孔作為給藥組。給藥組每孔各加入2 mL 300 μg/mL的RPS-1、RPS-2和RPS-3。24 h后使用不含EDTA胰酶消化，用PBS洗滌后在給藥組中加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶（PI）染色液［13］。將對(duì)照組細(xì)胞等分為4份，分為空白管、Annexin V-FITC單染管、PI單染管和Annexin V-FITC/PI雙染管。室溫避光孵育20 min，過細(xì)胞篩后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FlowJo軟件分析早期凋亡率和晚期凋亡率。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)值資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析或雙因素方差分析（ANOVA）比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑根霉胞外多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

利用高效凝膠過濾色譜（HPSEC）檢測(cè)RPS-1、RPS-2和RPS-3的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布（圖1），RPS-1、RPS-2 和RPS-3 的保留時(shí)間分別為8.750、8.762 和8.437 min，重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為43693、85471和14197 Da。RPS-2 在10.90 min 處存在雜峰，15.25 min處為溶劑峰。由峰面積大小可知，RPS-2含量相對(duì)較低。RPS-1、RPS-2和RPS-3的多分散指數(shù)分別為1.30、1.34和1.29。

圖1 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖HPSEC色譜圖Fig.1 High pressure size exclusion chromatography of polysaccharides with different molecular masses from Rhizopus nigricans.

2.2 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

黑根霉胞外多糖對(duì)DPPH自由基具有一定的清除活性。RPS-1、RPS-2和RPS-3在4.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率分別為48.36%、29.55%和24.24%，并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在給藥濃度為1.0～4.0 mg/mL時(shí)，RPS-1對(duì)DPPH自由基的清除活性顯著高于RPS-2和RPS-3（P<0.05）（圖2A）。

2.3 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力

3種不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖具有較好的ABTS自由基清除活性，當(dāng)給藥濃度為0.125～1.0 mg/mL時(shí)，RPS-3對(duì)ABTS自由基的清除活性顯著高于RPS-1和RPS-2（P<0.05），當(dāng)給藥濃度為2.0 mg/mL和4.0 mg/mL時(shí)，RPS-1對(duì)ABTS自由基的清除活性顯著高于RPS-2和RPS-3（P<0.05）。RPS-1、RPS-2和RPS-3在4.0 mg/ml時(shí)對(duì)DPPH 自由基清除率分別為67.14%、54.70%和62.48%（圖2B）。

2.4 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

RPS-1、RPS-2和RPS-3具有較好的羥自由基清除能力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，RPS-3對(duì)羥自由基的清除活性顯著高于RPS-1和RPS-2（P<0.01），且RPS-1和RPS-3對(duì)羥基自由基清除率呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。RPS-1、RPS-2和RPS-3在4.0 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率為89.94%、24.99%和97.26%。當(dāng)給藥濃度高于1.0 mg/mL時(shí)，RPS-3對(duì)羥基自由基的清除能力高于陽性對(duì)照Vc（圖2C）。

圖2 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖和維生素C 對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基清除率Fig.2 Comparison of DPPH,ABTS,and hydroxyl radical scavenging capacity between polysaccharides with different molecular masses and vitamin C.A:DPPH radical scavenging capacity assay.B:ABTS radical scavenging capacity assay.C:Hydroxyl radical scavenging capacity assay.*P<0.05,**P<0.01.Data are presented as Mean±SD of three independent experiments.

2.5 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

RPS-1、RPS-2和RPS-3在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均能抑制小鼠前胃癌MFC細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞增殖（圖3）。在1.0 mg/mL時(shí)，RPS-1、RPS-2和RPS-3對(duì)MFC細(xì)胞增殖的抑制率分別為12.68%、32.22%和14.4%，對(duì)A549 細(xì)胞增殖的抑制率分別為20.35%、37.07%和15.75%，且RPS-2對(duì)MFC和A549細(xì)胞增殖的抑制率高于RPS-1和RPS-3（P>0.05）。

圖3 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)MFC和A549細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of polysaccharides with different molecular masses on proliferation of MFC(A)and A549 cells(B).

2.6 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7增殖和一氧化氮含量的影響

3種不同相對(duì)分子質(zhì)量的黑根霉胞外多糖均能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞增殖。當(dāng)RPS-1、RPS-2和RPS-3為1.0 mg/mL時(shí)，RAW 264.7細(xì)胞的存活率分別為187.0%、199.6%和150.0%（圖4A）。其中RPS-2促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞增殖的活性顯著高于RPS-1和RPS-3（P<0.05）。一氧化氮（NO）是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，巨噬細(xì)胞可以通過釋放NO來發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPS-2處理后的RAW 264.7細(xì)胞釋放的NO含量顯著高于RPS-1和RPS-3（P<0.01）（圖4B）。

圖4 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖和NO含量的影響Fig.4 Effects of the 3 polysaccharides on proliferation(A)and NO production(B)of RAW 264.7 cells.*P<0.05 vs control group,**P<0.01 vs control group,##P<0.01.

2.7 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡

不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖均可以顯著誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡（P<0.01，5A），在RPS-1、RPS-2和RPS-3的濃度為0.4 mg/mL時(shí)，RPS-2處理后A549細(xì)胞的凋亡率顯著高于RPS-1 和RPS-3（P<0.05，圖5B）。

圖5 不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Flow cytometric analysis of apoptosis rates of A549 cells treated with RPS-1,RPS-2 and RPS-3 (0.4 mg/mL).Data are presented as Mean±SD of 3 independent experiments.*P<0.05 vs control group,**P<0.01 vs control group,#P<0.05 and##P<0.01.

3 討論

黑根霉胞外多糖的產(chǎn)量為196 mg/L，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖組成，其摩爾比例為5.89∶3.64∶3.2∶1。黑根霉胞外多糖主要的糖苷鍵連接方式是→6）Glcp（1→，為吡喃型糖，既含有α型糖苷又含有β型糖苷［2］。黑根霉胞外多糖具有較好的抗腫瘤活性，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬［14］，增強(qiáng)正常小鼠和免疫低下小鼠的免疫功能，抑制小鼠胃癌、結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展，抑制小鼠肝癌的發(fā)展和肺轉(zhuǎn)移［15］。

體內(nèi)產(chǎn)生的過量氧自由基可以誘導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜降解，從而引起細(xì)胞的破壞和機(jī)體的損傷，是癌癥、心血管疾病、糖尿病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的共同誘因，抗氧化劑可以用于上述疾病的預(yù)防和輔助治療［16-17］。天然多糖具有較好的抗氧化活性，由于相對(duì)分子質(zhì)量可以影響多糖的抗氧化活性，因此研究不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖的抗氧化活性對(duì)提高多糖抗氧化性能具有重要意義。本文研究了3種不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖的抗氧化活性，研究結(jié)果表明中等相對(duì)分子質(zhì)量多糖RPS-1對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除活性顯著高于高相對(duì)分子質(zhì)量多糖RPS-2（P<0.05），低相對(duì)分子質(zhì)量多糖RPS-3對(duì)羥自由基的清除活性顯著高于RPS-1和RPS-2（P<0.01），表明低、中相對(duì)分子質(zhì)量多糖的抗氧化活性高于高相對(duì)分子質(zhì)量多糖。Chen等［18］研究發(fā)現(xiàn)中等相對(duì)分子質(zhì)量玉米須多糖對(duì)DPPH和羥自由基的清除活性和還原力高于高相對(duì)分子質(zhì)量多糖；LI Wang等［19］研究表明低相對(duì)分子質(zhì)量平菇多糖對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除活性高于高相對(duì)分子質(zhì)量多糖，均與本文的研究結(jié)果一致。黑根霉胞外多糖的相對(duì)分子質(zhì)量較高，含有大量具有還原性的半縮醛羥基，可以提供活潑氫與·OH結(jié)合生成水，從而降低·OH對(duì)機(jī)體的損傷；多糖的碳原子因此成為碳自由基，并進(jìn)一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對(duì)機(jī)體無害的產(chǎn)物［20］。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)是多糖發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑，Chen等［21-22］研究發(fā)現(xiàn)玉竹多糖能夠可以誘導(dǎo)人食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞凋亡并且激活巨噬細(xì)胞。研究表明，多糖可以通過與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上死亡受體結(jié)合，經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將凋亡信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［23-24］。同時(shí)，多糖可以與巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體、甘露糖受體、補(bǔ)體受體3、清道夫受體等模式識(shí)別受體結(jié)合，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能［25-26］。多糖與其受體的結(jié)合依賴于多糖復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而相對(duì)分子質(zhì)量是影響多糖空間構(gòu)象的重要因素，研究不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖的抗腫瘤活性和免疫活性具有重要意義［27］。本文研究了三種不同相對(duì)分子質(zhì)量黑根霉胞外多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響和對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性的影響，發(fā)現(xiàn)高相對(duì)分子質(zhì)量多糖RPS-2對(duì)MFC和A549細(xì)胞增殖的抑制活性高于RPS-1和RPS-3（P>0.05）；RPS-2處理A549細(xì)胞24 h后，早期、晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著高于RPS-1和RPS-3（P<0.05）。RPS-2處理RAW 264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率和NO釋放量均顯著高于低、中相對(duì)分子質(zhì)量多糖RPS-1和RPS-3（P<0.05）。李蘋等［28］研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量高于100 000的醋柴胡多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬活性顯著高于低相對(duì)分子質(zhì)量醋柴胡多糖（3.5～50 000和50～100 000）（P<0.05），Kim等［29］研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量在10 000～30 000的樺褐孔多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制活性和誘導(dǎo)凋亡活性高于低相對(duì)分子質(zhì)量樺褐孔多糖，均與本文的研究結(jié)果一致。高相對(duì)分子質(zhì)量多糖具有較好的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性可能是由于其復(fù)雜的空間構(gòu)象，易與巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面多種受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮生物活性。

綜上所述，黑根霉胞外多糖的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性與自身相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)，低和中相對(duì)分子質(zhì)量多糖具有較好抗氧化活性，高相對(duì)分子質(zhì)量多糖具有較好的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。本文為將來進(jìn)一步研究黑根霉胞外多糖的構(gòu)效關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支持，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。