劉 芬，周志斐，薛 洋，朱 斌，吳補領(lǐng)，陳發(fā)明

1西北婦女兒童醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710000；第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院2牙周病科，5頜面外科，陜西 西安 710000；3南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院頜面外科，廣東 深圳 518000；4西藏軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，西藏 拉薩 850000；6南方醫(yī)科大學深圳口腔醫(yī)院（坪山），廣東 深圳518000

牙周炎是牙齒支持組織在炎性侵犯下受到破壞的一類疾?。?］。流行病學調(diào)查研究結(jié)果提示約10%的成年人和30%的50歲以上人群患有重度牙周炎。牙周炎不僅造成口腔局部組織礙害，還是多種全身系統(tǒng)性疾病的高危因素［2］。牙周治療的最終目標是實現(xiàn)牙周組織再生［3］。近年來，以干細胞為主導的組織工程技術(shù)逐漸成為實現(xiàn)穩(wěn)定牙周再生的研究熱點和臨床趨勢。組織工程技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用為牙周炎患牙的存留和預(yù)后改善提供了極大可能［4］。

牙骨質(zhì)是覆蓋牙根表面的薄層礦化組織。只有當牙骨質(zhì)存在時，以膠原纖維為主要結(jié)構(gòu)的牙周膜才能穿通其中，建立類似天然牙的Sharpy's纖維結(jié)構(gòu)并發(fā)揮作用效應(yīng)。因此，牙骨質(zhì)的再生重建是整個牙周組織功能性再生的前提，也是牙周組織再生研究中的難點與挑戰(zhàn)。

釉基質(zhì)蛋白衍生物（EMD）是最早用于牙周炎臨床治療的輔助藥物［5］。動物學和人體組織學研究結(jié)果均提示EMD局部應(yīng)用可有效促進牙骨質(zhì)再生［6］。然而EMD促進牙骨質(zhì)再生的機制并不清楚，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用的療效優(yōu)化。組織蛋白酶K（CTSK）是硬組織代謝的重要調(diào)節(jié)因子［7］。已經(jīng)證實，CTSK基因突變可導致致密性成骨不全綜合征，這類患者口腔改變中較為典型的表現(xiàn)即為顯著的牙骨質(zhì)增厚，但增厚的牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。意味著CTSK基因突變可導致正常牙骨質(zhì)生成障礙［8］。提示CTSK在牙骨質(zhì)發(fā)育過程中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是牙骨質(zhì)再生的重要調(diào)控因子［9］。

作者在前期研究中也已證實EMD作用能夠促進牙周膜干細胞（PDLSC）成牙骨質(zhì)向分化，在細胞成牙骨質(zhì)向分化過程中CTSK表達特異性上調(diào)［10］。在此基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)外實驗進一步印證表達上調(diào)的CTSK對PDLSC成牙骨質(zhì)向分化具有促進作用［10］。然而，EMD上調(diào)CTSK表達的具體作用機制仍有待闡明。

本實驗擬首先通過microRNA芯片篩選EMD誘導PDLSC過程中差異表達的microRNA，之后驗證相關(guān)microRNA同CTSK表達及PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的相互作用關(guān)系。并觀察wnt信號通路在microRNA調(diào)節(jié)過程中是否發(fā)揮了相應(yīng)功效。以期為揭示PDLSC成牙骨質(zhì)分化過程中CTSK表達升高的機制提供實驗基礎(chǔ)，為明確調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵通路，實現(xiàn)更好的定向誘導提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 樣本來源

本研究所用細胞來自第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院牙槽外科因正畸治療需要而減數(shù)拔除的前磨牙或第三磨牙。所有供體牙齒均呈無齲健康狀態(tài)。在拔除前影像學檢查均提示無急慢性炎癥表現(xiàn)。所有牙齒來源的供體無全身系統(tǒng)性疾病，在近1年內(nèi)無吸煙史及影響全身狀況的特殊藥物服用史。樣本年齡分布為14～35歲，均值為21.5歲。

本研究實驗方案已獲口腔醫(yī)學院倫理審查委員會批準，且在實驗開始前面向每個患者及其監(jiān)護人告知實驗?zāi)康呐c牙齒收集的用途，在獲得知情同意之后正式簽署書面同意書。

1.2 PDLSC的分離與培養(yǎng)

PDLSC的分離培養(yǎng)步驟按照前期研究進行［11］。首先利用無菌磷酸鹽緩沖液（Beyotime Biotechnology）沖洗新鮮拔除的牙齒。之后仔細刮除根中1/3牙周膜組織并剪成大小約1×mm×1×mm×1×mm的小塊。利用5倍于組織塊體積的0.1% I 型膠原酶（Sigma-Aldrich，Spruce）37 ℃消化牙周膜組織15 min，之后加入等體積含有10%胎牛血清（HyClone）的α-MEM 培養(yǎng)液（HyClone）終止消化。離心棄去含膠原酶的混合液后用含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素（Invitrogen）和100 mg/mL鏈霉素（Invitrogen）雙抗的原代α-MEM培養(yǎng)液重懸牙周膜組織。最后，將牙周膜組織接種于六孔板，放置于37 ℃，含95%空氣和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

當組織塊周圍細胞融合，利用0.25%胰蛋白酶（pH=8.0～9.0,Beyotime）消化細胞。極限稀釋法收集單克隆增殖的細胞集落體外擴大培養(yǎng)獲得PDLSC［11］。本研究使用第2～4代PDLSC進行后續(xù)實驗。

1.3 EMD誘導

EMD（Biora）溶解于1 ml/L醋酸（Ruimen，Jinan）溶液中保存，其終濃度為10 mg/mL，保存溫度為-20 ℃。將EMD誘導組的PDLSC以1×104/孔密度接種于六孔板中。24 h后待細胞貼壁，更換含有終濃度為100 mg/L EMD的α-MEM培養(yǎng)液［10］。EMD誘導48 h后取樣觀察相關(guān)信號通路及調(diào)控因子的表達改變。

1.4 microRNA芯片檢測

MicroRNA芯片檢測樣本分為2組：實驗組為EMD誘導作用組PDLSC，對照組為無特殊處理PDLSC。EMD誘導終止細胞培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)液，利用PBS蕩洗2遍。分別向?qū)嶒灲M和對照組PDLSC中加入裂解/結(jié)合緩沖液（lysis/bingding buffer,Invitrogen），裂解細胞制成細胞懸液。吹打細胞懸液呈均勻狀態(tài)后轉(zhuǎn)移至EP管行microRNA 芯片檢測（Aksomics,Agilent Human miRNA Microarray,Release 21.0）。

1.5 RNA提取和RT-qPCR檢測

根據(jù)商品說明書，利用Trizol（Invitrogen）試劑提取RNA。之后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）將所得的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時定量PCR 的反應(yīng)體系為20 μL，基于RT-qPCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM II，Takara）的使用說明進行。RT-qPCR在CFX Connect?實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad,HercμLes）內(nèi)開展。對于每種檢測基因，獨立重復3次實驗檢測。在本實驗中所使用的引物序列如下（表1）。其中，由于miR-30a成熟形式差異通常較為輕微，因此在本研究中擴增其前體形式來比較miR-30a的表達差異。

表1 本研究所使用的引物序列Tab.1 Primer sequence used in this study

1.6 miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染

首先設(shè)計miR-30a 抑制劑序列：CUUCCAG UCGAGGAUGUUUACA；并同時設(shè)計陰性對照序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。在進行抑制劑轉(zhuǎn)染前，PDLSC的培養(yǎng)液更換為不含抗生素的α-MEM以保證理想的轉(zhuǎn)染效率。對miR-30a抑制劑和陰性對照序列分別進行稀釋，使其終濃度為100 nmol/μL。首先將10 μL抑制劑稀釋至250 μL，稀釋液為opti-MEM，作用10 min。此后，用250 μL opti-MEM 稀釋5 μL lip 2000，作用10 min。最后將兩者混合，輕輕吹打均勻后室溫作用20 min。用無血清的α-MEM將六孔板中的細胞清洗2次后每孔加入3 mL無血清α-MEM及抑制劑轉(zhuǎn)染體系。放入孵箱作用6 h后棄去無血清培養(yǎng)液，加入正常含10%胎牛血清的α-MEM，繼續(xù)孵育18 h。

1.7 蛋白提取和Western blot檢測

Western blot檢測按照前期研究步驟進行［12］。本實驗所用一抗如下：小鼠抗人磷酸化GSK-3β一抗（1∶200稀釋，Santa Cruz Biotechnology）；羊抗人DKK1 一抗（1∶200稀釋，Abcam）；小鼠抗人active-β-catenin一抗（1∶100稀釋，Millipore）；羊抗人CTSK一抗（1∶100稀釋，Santa Cruz）及小鼠抗人β-actin 一抗（1∶2000 稀釋，CWBiotech）。本實驗所用二抗為結(jié)合辣根過氧化物酶的羊抗小鼠二抗（1∶5000 稀釋，Jacson Immuno Research，West Grove）和驢抗羊二抗（1∶5000 稀釋，CWBiotech）。

1.8 動物實驗

為進一步研究PDLSC體內(nèi)異位成牙骨質(zhì)向分化，將不同處理（EMD誘導，miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染，CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染）的細胞膜片包被孔狀陶瓷羥基磷灰石材料（四川大學）植入裸鼠背部皮下。實驗步驟參照文獻［13］的方法進行。實驗動物的購買、飼養(yǎng)及處理方案經(jīng)空軍軍醫(yī)大學動物倫理委員會審查和批準。不同處理（EMD誘導，miR-30a抑制劑轉(zhuǎn)染，CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染）的PDLSC首先按照2×105/孔的密度植入六孔板中，含10%胎牛血清（HyClone）的α-MEM標準培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后換做EMD誘導培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d直至細胞膜片形成?？谞钐沾闪u基磷灰石材料被加工成3 mm×5 mm的圓柱形用作細胞支架。細胞-支架材料復合材料植入裸鼠（6周齡雄性，空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心）背部皮下。8周后處死實驗動物。取出復合材料通過免疫組織化學檢測分析相關(guān)改變。

1.9 免疫組織化學檢測

孔狀陶瓷羥基磷灰石材料固定后在10%EDTA溶液中脫鈣15 d。制備6 μm厚度的連續(xù)石蠟切片時，垂直圓柱形材料的長軸進行切取。本研究開展免疫組織化學檢測時所用的一抗有小鼠抗人CAP一抗（1∶500稀釋，Santa Cruz）及羊抗人CEMP-1 一抗（1∶500 稀釋，Santa Cruz）。滴加二抗及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（ZSGB-Bio）室溫孵育后利用DAB顯色液（Hat Biotechnology）進行顯色。Image Pro Plus 6.0（Azure Biosystems）軟件分析所拍攝的圖像。

1.10 CTSK慢病毒激活顆粒轉(zhuǎn)染

消化后將2×105細胞接種于6孔板，待其貼壁并生長至6孔板底部約60%面積時準備進行CTSK慢病毒激活顆粒（Santa Cruz）轉(zhuǎn)染。首先在α-MEM培養(yǎng)液中加入5μg/mL聚凝胺（Polybrene?，Santa Cruz）作用12 h，之后將慢病毒顆粒添加入細胞培養(yǎng)體系。應(yīng)用包含有5μg/mL二鹽酸嘌呤霉素（Santa Cruz），300μg/mL潮霉素B（Santa Cruz）以及10 μg/mL 鹽酸殺稻瘟菌素S（Santa Cruz）的α-MEM，針對表達穩(wěn)定的含有CTSK慢病毒激活顆粒細胞進行挑選。每間隔3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.11 統(tǒng)計分析

各實驗使用不同批次細胞獨立重復3次，各指標以均數(shù)±標準差表示。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。不同組間的樣本對比使用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EMD作用PDLSC后差異表達microRNA的芯片檢測

芯片檢測結(jié)果提示（表2），EMD誘導48 h后，15種microRNA表達出現(xiàn)下調(diào)，21種microRNA表達出現(xiàn)上調(diào)。在表達發(fā)生變化的36種microRNA中，同細胞增殖相關(guān)的microRNA有14種，分別為：miR-100、miR-1183、miR-144-3p、miR-182、miR-134、miR-141、miR-143、miR-21、miR-101-3p、miR-30a、miR-1、miR-1060、miR-424、miR-138。同細胞分化相關(guān)的microRNA有16種，分別為：miR-31、miR-144-3p、miR-214、miR-9、miR-145、miR-143、miR-451、miR-486、miR-24、miR-21、miR-210、miR-223、miR-133、miR-1256、miR-30a、miR-155。同細胞增殖與分化均密切相關(guān)的microRNA有4種，分別為：miR-144-3p、miR-143、miR-21、miR-30a。其中，miR-144-3p和miR-143表達下調(diào)，miR-21和miR-30a表達上調(diào)。

2.2 EMD作用后PDLSC差異表達microRNA的篩選

對初篩的4種microRNA進行實時定量PCR檢測（圖1）：EMD作用24 h后，miR-144-3p表達下調(diào)，這一下調(diào)趨勢持續(xù)至48 h（P<0.05）。至EMD 作用72 h，miR-144-3p 表達同對照組相比已無統(tǒng)計學差異（P>0.05，圖1A）。而對于miR-143，在各個檢測時間點其表達變化差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖1B），這一結(jié)果與microRNA基因芯片結(jié)果相悖。在EMD 誘導24 h后，miR-30a的表達無顯著改變（P>0.05），但在48 h后，miR-30a的表達逐漸升高，且呈時間依賴性（P<0.05，圖1C）。而miR-21的表達在EMD作用延長至96 h時，上調(diào)趨勢得到抑制，差異同EMD作用24 h相比并不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖1D）。后續(xù)實驗選擇miR-30a為研究對象。

2.3 miR-30a在EMD上調(diào)PDLSC CTSK表達中的作用

首先通過miR-30a抑制劑沉默PDLSC中miR-30a的表達。細胞模型構(gòu)建成功后利用實時定量PCR進行驗證（圖2）。EMD誘導48 h后，PDLSC中miR-30a表達上調(diào)（P<0.05）。miR-30a抑制劑作用組的細胞miR-30a表達下調(diào)，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-30a抑制劑作用組的細胞在EMD作用下miR-30a表達上調(diào)的趨勢得到逆轉(zhuǎn)。

圖2 EMD及miR-30a抑制劑對PDLSC miR-30a表達變化的影響Fig.2 Effects of EMD and miR-30a inhibitor toward the expression of miR-30a in PDLSC.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

當抑制PDLSC中miR-30a的表達后，CTSK無論mRNA（圖3A）還是蛋白（圖3B）的表達上調(diào)趨勢均得到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖3 EMD及miR-30a抑制劑對PDLSC CTSK表達變化的影響Fig.3 Effects of EMD and miR-30a inhibitor on expression of CTSK in PDLSC.A:qPCR results showing the effect of miR-30a inhibition on CTSK mRNA expression in PDLSC with EMD induction.B:Western blotting results of CTSK protein expression.**P<0.01.

進一步將不同處理的PDLSC復合支架材料植入裸鼠皮下，觀察細胞在體內(nèi)異位成牙骨質(zhì)向分化的情況（圖4）。EMD作用后PDLSC成牙骨質(zhì)向分化作用顯著增強。而在miR-30a表達被沉默后，細胞在EMD誘導環(huán)境中定向分化能力減弱。但在增強miR-30a表達沉默PDLSC中CTSK的活性后，miR-30a抑制劑對PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)。

圖4 miR-30a調(diào)控PDLSC CTSK表達對細胞成牙骨質(zhì)向分化的影響Fig.4 Effects of miR-30a inhibitor and CTSK activator on cementogenic differentiation of PDLSCs.Up:Original magnification:×40;Down:×200.

2.4 miR-30a通過wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)PDLSC CTSK的表達

Western blot檢測顯示在EMD誘導48 h后，PDLSC中wnt/β-catenin信號通路被特異性激活，表現(xiàn)為磷酸化GSK-3β表達上調(diào)，活化型β-catenin表達顯著升高（圖5）。而wnt通路的抑制因子DKK1表達降低。當利用miR-30a 抑制劑沉默PDLSC miR-30a表達后，EMD對wnt信號通路的活化作用減弱。

圖5 EMD及miR-30a抑制劑對PDLSC wnt通路相關(guān)因子蛋白表達的影響Fig.5 Effects of EMD and miR-30a inhibitor on expressions of related proteins of wnt signaling pathway in PDLSCs.

而當利用wnt 信號通路特異性阻斷劑DKK1（10 ng/mL）阻斷PDLSC wnt信號通路后，qPCR檢測顯示EMD誘導環(huán)境中PDLSC CTSK表達上調(diào)的趨勢得到部分逆轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖6A）。蛋白檢測結(jié)果（圖6B）進一步印證了mRNA檢測發(fā)現(xiàn)。

圖6 EMD及DKK1對PDLSC CTSK表達變化的影響Fig.6 Effects of EMD and DKK1 on expression of CTSK in PDLSC.A:qPCR results of CTSK mRNA expression in PDLSCs with EMD induction after inhibiting the wnt signaling pathway.B:Western blotting of CTSK protein expression.*P<0.05,**P<0.01.

3 討論

本實驗通過microRNA基因芯片結(jié)合qPCR驗證發(fā)現(xiàn)EMD 誘導PDLSC 成牙骨質(zhì)向分化過程中miR-30a表達特異性上調(diào)。EMD通過miR-30a調(diào)控CTSK表達促進PDLSC成牙骨質(zhì)向分化。而miR-30a調(diào)節(jié)CTSK表達進而發(fā)揮功能效應(yīng)可能經(jīng)由wnt/β-catenin信號通路。

MicroRNA同干細胞分化密切相關(guān)。包括腫瘤間質(zhì)細胞在內(nèi)的多種干細胞或前體細胞中廣泛存在microRNA的表達，不同表達量的microRNA對細胞功能的影響發(fā)揮著不同作用，影響著細胞增殖和分化等基本功能［14］。因此，microRNA在多種疾病的病理發(fā)生和病程調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵效應(yīng)。在皮膚組織中，microRNA能夠調(diào)控基底細胞的“干性”促進新陳代謝，維持皮膚組織穩(wěn)態(tài)［15］。肌細胞中，以miR-206為代表的microRNA其主要作用就在于促進肌細胞的前體細胞分化形成肌肉組織［16］。在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中，也存在microRNA 表達譜的改變，提示這一過程同樣受microRNA調(diào)控［17］。MicroRNA主要通過作用于目標mRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因此其在細胞中的效應(yīng)機制較為復雜。多個microRNA可能作用于同一個mRNA，也有可能單個microRNA下游存在多個可能的靶向mRNA。在本實驗中，我們通過microRNA芯片對PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中差異性表達的microRNA進行了篩選，結(jié)果也提示15種microRNA表達下調(diào)，21 種microRNA表達上調(diào)。提示microRNA對PDLSC的分化也發(fā)揮著可能的調(diào)控作用。

在表達發(fā)生改變的microRNA中，miR-144-3p［18-19］、miR-143［20-21］、miR-30a［22-23］和miR-21［24-25］同細胞增殖及分化均密切相關(guān)。結(jié)合實時定量PCR結(jié)果，最終選擇miR-30a作為后續(xù)研究的目標。miR-30a作為同細胞分化和增殖均密切相關(guān)的microRNA，在EMD作用后的PDLSC中表達上調(diào)且表達趨勢較為穩(wěn)定。通過體內(nèi)實驗我們也證實其參與了PDLSC成牙骨質(zhì)向分化和對這一過程關(guān)鍵因子CTSK的表達調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)與前期研究類似。學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-30a是間充質(zhì)細胞成軟骨分化過程中的重要調(diào)節(jié)因子［26］。不僅能夠通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子直接影響細胞分化，還可能同淋巴細胞等相互作用發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)間接對細胞分化產(chǎn)生影響［23］。在口腔牙周組織中，miR-30a不僅參與了牙周組織炎性損傷，也調(diào)節(jié)著牙周炎患者組織修復過程［27］，這一發(fā)現(xiàn)與本研究類似。本實驗研究結(jié)果擴大了對miR-30a在干細胞分化尤其是口腔牙周組織來源間充質(zhì)干細胞多向分化過程中的認識。

在明確miR-30a對CTSK發(fā)揮調(diào)控作用進而調(diào)節(jié)PDLSC成牙骨質(zhì)向分化后，我們觀察了wnt信號通路在這一調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮的可能分子機理。既往已有多個研究證實wnt/β-catenin信號通路是礦化組織發(fā)生和再生的調(diào)節(jié)通路［28］。它可以通過調(diào)控包括PDLSC在內(nèi)的間充質(zhì)干細胞增殖和分化促進骨及類骨組織形成［29］。在本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMD誘導作用下wnt通路相關(guān)因子p-GSK-3β和核心調(diào)控因子活化型β-catenin表達均出現(xiàn)上調(diào)，而通路抑制因子DKK1表達則顯著下調(diào)。提示在PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中伴隨wnt/β-catenin信號通路的激活。但較之于骨髓間充質(zhì)干細胞及其他組織來源間充質(zhì)干細胞，wnt信號通路在牙周組織穩(wěn)態(tài)的維持中功能作用發(fā)揮仍有一定爭議。雖然體外實驗證實wnt通路能夠上調(diào)牙周膜組織來源細胞表達成骨分化標志物如Osterix，Runx2和ALP［30］，也有學者發(fā)現(xiàn)wnt通路能夠抑制牙周膜細胞成牙骨質(zhì)向分化，這一結(jié)果與本實驗結(jié)果相悖，作者考慮與誘導微環(huán)境存在關(guān)聯(lián)。Wnt通路在PDLSC牙周再生應(yīng)用或成牙骨質(zhì)向分化中的具體作用機制尚需進一步研究［31］。

Wnt信號通路不僅參與以PDLSC作為種子細胞的牙周組織再生，其功能作用發(fā)揮也受microRNA的調(diào)節(jié)。MiR-128通過調(diào)控wnt通路能夠影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化［32］；wnt3a受miR-410的負性調(diào)控從而促進人骨髓間充質(zhì)干細胞向成軟骨方向分化［33］，而miR-27則可以靶向作用于APC激活wnt信號通路促進成牙本質(zhì)細胞分化［34］。具體到miR-30a，已有學者證實miR-30a可以靶向作用于PR結(jié)構(gòu)域蛋白1基因通過DKK1調(diào)控wnt信號通路從而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。此外，miR-30a和wnt/β-catenin信號通路之間的交互作用也為骨髓瘤的治療提供了新的思路［35］。我們的研究結(jié)果也提示，EMD 誘導作用下，PDLSC miR-30a的表達和wnt信號通路的激活間存在相關(guān)性，且wnt信號通路的激活影響PDLSC成牙骨質(zhì)向分化重要調(diào)控因子CTSK的表達。

MicroRNA功能作用的發(fā)揮多在于其通過負性調(diào)控靶基因的表達進而影響下游通路。在本研究中，我們初步探討了PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中CTSK表達上調(diào)的機制，即EMD上調(diào)miR-30a的表達進而通過激活wnt信號通路上調(diào)CTSK表達。由此作者推測MiR-30a上調(diào)wnt信號通路的可能途徑有兩條：其一在于直接靶向作用于wnt通路的負性調(diào)控因子，但相關(guān)機制有賴于進一步生物信息學的驗證；其二在于間接作用于下游的靶向轉(zhuǎn)錄因子進而間接抑制wnt通路。因此，在后續(xù)研究中，作者將進一步通過生信分析來明確miR-30a激活wnt 通路的目標靶基因并通過系列實驗進行驗證。此外，miR-30a-wnt/β-catenin信號軸在PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中除調(diào)節(jié)CTSK的表達外，是否可能存在其他功能作用，也是后續(xù)研究的方向之一。

結(jié)合前期研究，本實驗結(jié)果進一步表明CTSK是EMD通過miR-30a調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵靶點。然而，現(xiàn)有文獻缺乏CTSK在wnt通路作用下自身表達調(diào)控及調(diào)控干細胞定向分化的效應(yīng)機制相關(guān)報道。在后續(xù)研究中，作者將結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子芯片及生物信息學分析等技術(shù)，以CTSK為中心，深入開展效應(yīng)機制的探索。

綜上所述，PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中，EMD可能通過上調(diào)miR-30a的表達激活wnt/β-catenin信號通路從而經(jīng)CTSK誘導PDLSC向成牙骨質(zhì)細胞方向分化。本研究有望為揭示PDLSC成牙骨質(zhì)向分化過程中CTSK表達升高的機制提供實驗基礎(chǔ)，也為明確調(diào)控PDLSC成牙骨質(zhì)向分化的關(guān)鍵通路實現(xiàn)更好的定向誘導提供理論依據(jù)。