楊溥原，梁紅凱，殷叢培，崔江慧，常金華

（河北農業(yè)大學 農學院， 河北 保定 071001）

高粱(Sorghum bicolorL.)是我國五大糧食作物之一，廣泛應用于釀造、畜牧、制糖等多個產業(yè)。隨著農業(yè)結構調整，高粱地位愈發(fā)重要。近年來復雜多變的氣候條件，對高粱產量和品質造成較大影響[1]。有研究表明烯效唑通過調節(jié)植株內源激素平衡，使植物的生理特性、形態(tài)指標產生變化，從而達到調節(jié)植株生長和改善植株生理特性，減輕植株在逆境脅迫下受損害的目的[2]。GRAS轉錄因子是植物生長發(fā)育中不可或缺的一類蛋白，利用生物信息學技術對高粱GRAS家族基因進行分析，旨在探索高粱GRAS基因功能，并挖掘與激素調節(jié)相關的GRAS基因，探索其在植物生長調控中的作用。GRAS轉錄因子最先鑒定出的3個家族成員分別是 Gibberellic acid insensitive(GAI)，Repressor of GA1(RGA)和 Scarecrow(SCR)[3]，從而定義了GRAS轉錄因子。一般來說，GRAS蛋白C末端含有多個高度保守的基序，即為GRAS結構域，而特異性主要表現(xiàn)在可變的N末端，不同的N端基序可使該類蛋白與不同靶蛋白結合，即增加了基因功能的多樣性[4-5]。自2004年第一個GRAS家族鑒定以來[6]，玉米(Zea maysL.)、小麥(Triticum aestivumL.)、大豆(Glycine maxL.)以及棉花(Gossypium hirsutumL.)等約300種作物中分別鑒定出GRAS蛋白[7-10]。不同物種之間，GRAS亞族分類不同，如早期擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻和玉米的GRAS蛋白可根據結構差異分為8個亞家族[4]，即DELLA、SCR、LS、PAT1、HAM、SCL3、SHR和LISCL亞家族，后來隨著基因組學研究的深入，GRAS家族又被分為10～16個亞族[11-12]。不同的亞族參與的生理生化反應各不相同，如DELLA是赤霉素(GA)信號通路的負調控因子，當接收到細胞外GA信號時會在細胞核降解，并傳遞出GA正常的信號維持植株正常發(fā)育，DELLA突變體則表現(xiàn)為因GA不敏感性導致植株矮小[13]；SCL3位于GA信號轉導通路下游，對GA其正向調節(jié)作用，維持植物體內赤霉素平衡，與DELLA蛋白互為拮抗作用[14]；LS和HAM蛋白被證實在多個物種中參與分生組織形成；SCR與SHR蛋白可正向調控根系生長，但當SCR與SHR蛋白正常代謝時，葉片生長受到抑制[15]；PATI光信號轉導通路中重要的一環(huán)，擬南芥AtPAT1被證實對光敏色素A信號傳導起正向調節(jié)作用[16]；LISCL亞族在植物響應逆境脅迫時發(fā)揮重要作用且會參加生長素反應中不定根形成的過程[17]。因此，GRAS蛋白可以廣泛參與激素信號轉導、分生組織發(fā)育及脅迫應答等多種生理反應。目前，本研究對高粱全基因組進行GRAS家族鑒定，對其理化性質、進化關系、基因結構等進行分析；以烯效唑處理下的高粱轉錄組數據，篩選出部分差異表達基因，并利用qRT-PCR分析差異基因的表達模式，鑒定該家族中潛在響應激素調節(jié)的基因。

1 材料與方法

1.1 材料準備及轉錄組測序

本試驗所用高粱材料為‘紅1號’，于2019年種植在河北農業(yè)大學育種中心，待高粱長到七葉期時，對其噴施濃度為1.1 g/L的烯效唑，分別于處理后0、3、7和14 d取旗葉，每組處理連續(xù)取3株，樣品迅速放置于-80℃冰箱。利用TRNzol法提取高粱總RNA，用Nandorop One超微量分光光度計測定濃度和質量（OD260/280），高質量樣品RNA用于構建文庫并進行Illumina測序，獲得轉錄組數據，后續(xù)分析基于此轉錄組數據。

1.2 高粱GRAS基因家族鑒定及分類

為挖掘鑒定高粱GRAS蛋白，本研究于Ensembl Plants網 站（http://plants.ensembl.org/index.html）下載高粱全基因組數據；pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載GRAS隱馬克夫模型[18]，并利用Linux版本的HMMER軟件進行鑒定，E值設置小于10-5，去除冗余的序列，初步得到高粱GRAS蛋白序列[19]；利用pfam-search（http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）與Smart（http://smart.embl.de/）對GRAS蛋白序列進行驗證，最終保留含有GRAS結構域的蛋白。

1.3 理化性質分析及染色體定位

利用ExPASy-ProParam網站（https://web.expasy.org/protparam/）對高粱GRAS蛋白的氨基酸數、分子量和等電點進行預測。提取高粱GRAS基因的位置，通過Mapchart高粱GRAS基因在染色體上的分布情況可視化。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構建、保守結構域及基因結構分析

參照上述方法鑒定出擬南芥和谷子(Setaria italica)的GRAS蛋白，將3個物種的GRAS蛋白序列使用MEGA7.0的Muscle進行多序列比對，選擇鄰接法（Neighbor-Joining），Bootstrap method設置為1 000，構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]，并根據GRAS基因結構進行亞家族分類。利用在線網站MEME（http://meme-suite.org） 及 GSDS2.0（http://gsds.gao-lab.org/）對高粱GRAS基因進行保守結構域及基因結構預測。

1.5 共線性分析

利用Blast對高粱全基因組數據進行比對，McscanX軟件對其進行共線性分析及篩選同源基因，通過Circos軟件繪制共線性關系圖譜[21]；利用相同方法處理擬南芥和谷子的全基因組數據，通過McscanX軟件將高粱與擬南芥和谷子之間的同源關系可視化。

1.6 順式作用元件分析

截取高粱GRAS基因上游啟動子的1 500 bp序列，提交至在線網站Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），篩選與植物生長發(fā)育、激素代謝和脅迫應答相關的元件進行分析。

1.7 高粱GRAS基因注釋

將高粱GRAS基因提交至GO數據庫（http://geneontology.org/）進行BP、MF、CC注釋分類；利用KEGG（https://www.kegg.jp/）對GRAS蛋白參與的pathway通路進行注釋[22]。

1.8 基因表達分析及熒光實時定量

采用 FPKM（Fragments per kilobase million）法計算烯效唑處理下高粱轉錄組測序文庫各基因表達量，利用Tbtools繪制不同時期GRAS基因表達熱圖。

利用轉錄組同批RNA，選取高粱glactin作為內參基因，利用Primer 5.0設計引物（表1），反轉錄后進行熒光實時定量（qRT-PCR, Quantitative Realtime PCR），采用2-△△Ct法計算相對表達量，每組處理樣品設置3次生物學重復和3次技術重復。

表1 實時熒光定量所用引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.9 數據分析

利用SPSS25對熒光實時定量結果進行方差分析，采用鄧肯方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 高粱GRAS基因家族鑒定與理化性質分析

利用GRAS的隱馬克夫模型從高粱全基因組序列中鑒定出80個GRAS轉錄因子，通過ExPASy-ProParam在線網站預測其理化性質。如表2所示，80個高粱GRAS轉錄因子氨基酸數為295～967個，分子量大小為31 529.21～107 470.03 kD；等電點介于4.82～9.05之間，平均等電點為6.01，其中91.25%為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數介于34.19～63.88，根據Sarikaya等人的研究[23]，不穩(wěn)定系數高于40為不穩(wěn)定蛋白，即高粱GRAS蛋白中96.25%為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數介于60.62～97.14；平均親水性為-0.264，其中95%為親水性蛋白，由此可知高粱GRAS家族成員內的理化性質也存在一定差異。圖1為高粱GRAS基因染色體定位圖，由圖所示，除7號染色體外，80個GRAS基因全部定位于高粱9條染色體上，且全部定位到染色體兩端；其中5號染色體GRAS基因最多（25個），10號染色體GRAS基因最少，僅3個。

表2 高粱GRAS基因一級結構及理化性質分析Table 2 Analysis of primary structure and physicochemical property of GRAS genes in sorghum

續(xù)表：

續(xù)表：

圖1 高粱GRAS家族基因染色體定位圖Fig.1 Chromosomal mapping of sorghum GRAS family genes

2.2 GRAS基因家族系統(tǒng)進化分析

利用MEGA7.0將篩選得到的高粱（80個）、擬南芥（34個）、谷子（56個）的GRAS蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據親緣關系遠近，170個GRAS蛋白序列可劃分為8個亞家族，分別為HAM、LS、SCR、DELLA、SCL3、SHR、PAT1和LISCL。其中LS、SCR和DELLA亞族高粱GRAS成員最少，僅4個；SHR和PAT1亞族成員各7個；HAM亞族成員9個；LISCL是高粱GRAS家族中最大的亞家族，與玉米相似[5]，成員達38個，占全部高粱GRAS家族的47.5%。

2.3 保守結構域與基因結構分析

通過MEME和GSDS在線網站對高粱80個GRAS家族成員進行分析，利用TBtools將GRAS基因的保守結構域和基因結構可視化（圖3）。如圖所示，利用MEME在高粱GRAS基因預測了20個Motif，80個GRAS基因之間包含的Motif種類及數量具有一定差異，但同一亞族之間具有相似的保守結構域，說明相同亞族之間可能具有相似的功能。某些亞族中還具備特定的Motif，如LISCL亞族相對于其他亞族，C端有特定的4個motif，即motif10、motif13、motif16和motif19，這與前人研究相似，且除SbGRAS43和SbGRAS53外，其余基因N端都具有1個特定保守結構域（Motif5）等。通過基因結構分析可以看出，所有高粱GRAS基因都含有1～5個編碼區(qū)（CDS）；22個基因無非編碼區(qū)（UTR），占全部高粱GRAS基因的27.5%；24個基因分別有1～4個內含子，其余GRAS基因無內含子；相同亞族內的基因大多具有相似的基因結構，SbGRAS53和SbGRAS54與其他GRAS基因具有明顯不同的基因結構，推測其在進化過程中曾發(fā)生變異。

圖2 GRAS基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of GRAS gene family

圖3 高粱GRAS基因家族保守結構域及基因結構Fig.3 Conserved components and gene structure of GRAS gene family in sorghum

2.4 共線性分析

基因復制對物種基因組進化、擴張及功能分化有重要意義[24]。通過對高粱GRAS基因繪制共線性圖譜（圖4），結果顯示高粱11個GRAS基因存在6對共線性關系，無串聯(lián)重復基因，其中SHR、PAT1、SCL3和HAM亞族各一對同源基因，SCR亞族存在2對同源基因。5號和8號染色體中存在3對同源基因，2個同源基因位于9號染色體，其余3個分別位于1號、2號與3號染色體。對高粱、擬南芥和谷子構建物種間GRAS共線性圖譜（圖5），由圖可知，高粱與擬南芥存在7對共線性關系，與谷子存在46對共線性關系。因此，GRAS基因存在早于單子葉植物與雙子葉植物的分化時間。

圖4 高粱GRAS基因家族共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of sorghum GRAS gene family

圖5 高粱與擬南芥、谷子GRAS基因家族共線性分析Fig.5 Collinearity analysis of GRAS gene family in sorghum with Arabidopsis and foxtail millet

2.5 順式作用元件

利用在線網站Plant CARE預測高粱GRAS基因上游 1 500 bp啟動子的順式作用元件[25]，篩選出與生長發(fā)育、激素調節(jié)及逆境脅迫應答相關的順式作用元件進行分析。如圖6所示，搜索出大量與生長發(fā)育相關的元件，如光響應元件與種子特異性調節(jié)元件等、與激素調節(jié)相關的有ABA響應元件、GA響應元件及IAA響應元件等、與逆境脅迫相關的包括抗氧化逆境脅迫元件、生物及非生物脅迫應答元件、防御脅迫響應元件，以及與鹽、干旱、低溫脅迫相關的一系列順式作用元件。67個GRAS基因含有不同的激素相關響應元件，其中34個基因存在GA響應元件；77個GRAS基因存在響應不同脅迫應答的相關元件；23個GRAS基因存在與種子特異性調節(jié)相關的元件；全部GRAS基因均含有光響應相關元件。因此，推測高粱GRAS基因可能廣泛參與植物生長發(fā)育過程中的多種生理生化反應。

圖6 高粱GRAS基因家族順式作用元件Fig.6 Cis-acting elements of sorghum GRAS gene family

2.6 高粱GRAS家族成員GO與KEGG分析

對高粱GRAS基因進行GO分析（圖7），80個GRAS基因全部得到Biological process（BP）、Cellular component（CC）及Molecular function（MF）注釋，發(fā)現(xiàn)GRAS基因參與20種生物過程（BP），其中全部基因均參與調控種子休眠過程；細胞成分（CC）全部為細胞核；注釋到3種分子功能（MF），其中全部基因均注釋到DNA結合轉錄因子活性與特異性DNA結合中。通過KEGG注釋高粱GRAS基因參與的代謝通路，發(fā)現(xiàn)大部分基因均參與植物激素信號轉導（K14494）與核糖體生物合成（K14777）途徑。

圖7 高粱GRAS基因GO注釋信息Fig.7 The GO annotations of sorghum GRAS genes

2.7 高粱GRAS基因對烯效唑調控的響應

本研究以外源生長調節(jié)劑烯效唑處理7葉期高粱幼苗，并設置對照組（CK）和處理組（T），分別于處理后0、3、7和14 d取新生展開第一片葉，進行轉錄組測序分析，經過濾分析得到32 423個表達基因，其中66個GRAS基因有所表達。

基于此轉錄組數據繪制高粱GRAS基因表達熱圖(圖7)，分析GRAS基因在不同時期的表達量變化規(guī)律。根據聚類情況，可將66個GRAS基因分為5類，Ⅰ中GRAS在對照和處理下表達量變化趨勢基本一致，大多基因的表達量均先降低，在7 d時顯著升高，隨后降低，但對照組和處理組的表達量之間無顯著差異；Ⅱ中表達趨勢大多呈現(xiàn)先升高，在3 d時達到頂峰，之后表達量下降，對照組和處理組之間的表達趨勢相同，且無顯著差異，推測在烯效唑處理下該類基因無明顯作用；Ⅲ中GRAS基因最多，且大多基因均呈現(xiàn)表達量持續(xù)升高的趨勢，其中SbGRAS7、SbGRAS15、SbGRAS16及SbGRAS29在烯效唑處理下14 d表達量顯著高于對照組14 d表達量；Ⅳ中各基因在處理和對照下表達趨勢一致，均呈現(xiàn)先升高后降低最后再升高的趨勢，其中僅SbGRAS44在7 d時表達量顯著降低，但CK7與T7之間無顯著差異；Ⅴ中基因表達量大多表現(xiàn)出先降低，在14 d時有升高的趨勢，但各個時期間的表達量變化不顯著，且對照組與處理組間的表達量變化差異不顯著。

為進一步驗證烯效唑處理下高粱GRAS基因表達模式，挑選了8個表達量較高且差異顯著的GRAS基因，進行qRT-PCR分析（圖9）。由于該8個基因在3 d時的表達量與0 d時相比基本無變化，所以僅對其在0、7、14 d 3個時期進行qRT-PCR。結果顯示，6個基因表達趨勢與轉錄組數據基本吻合，其中5個基因的表達量存在顯著差異。SbGRAS2與SbGRAS13呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在烯效唑處理7 d時達到顯著；SbGRAS7與SbGRAS15表達量持續(xù)升高，14 d時處理組表達量顯著高于對照組；SbGRAS58表達量也表現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢，但7 d和14 d時處理組表達量顯著低于對照組。

圖8 高粱GRAS基因在烯效唑處理下的表達模式Fig.8 The expression pattern of sorghum GRAS genes under uniconazole treatment

圖9 烯效唑處理下高粱GRAS基因的表達水平Fig.9 Expression level of sorghum GRAS genes under Uniconazole treatment

3 討論

GRAS轉錄因子廣泛存在于植物體中，參與植物生長發(fā)育中的多個代謝途徑。2009年高粱全基因組序列公布，為高粱基因功能挖掘提供理論基礎。本研究基于烯效唑處理下不同時期高粱轉錄組數據，結合生物信息學鑒定高粱GRAS基因，并通過qRT-PCR驗證功能。

本研究從高粱全基因組序列中鑒定出80個GRAS轉錄因子，與玉米（86個）相差不多，且同樣可以分為8個亞族。通過系統(tǒng)發(fā)育樹，根據親緣關系遠近，預測相同亞族間臨近分枝的蛋白功能可能相似，如AtGAI與AtRGA1的研究較為透徹[8]，他們可以參與GA信號轉導，抑制植株的生長與開花，而與其同源性較高的SbGRAS3和StGRAS3也可能存在類似功能；不同亞族之間結構差異較大，如motif5、motif10和motif19僅存在于LISCL亞族中，推測這些保守結構域導致LISCL亞族具有特異性功能；相同亞族之間結構相似，可能在基因功能方面存在一定相似性[26]，但在基因進化過程可能存在一定變異，如SbGRAS53和SbGRAS54與LISCL亞族其他基因的保守結構域極為相似，但基因結構存在明顯不同，這種變異可能使基因功能發(fā)生改變，對基因進化及功能分化有重要意義。相較于擬南芥，高粱與谷子的同源性更高，可以根據谷子GRAS基因預測高粱中同源基因的功能。通過對高粱GRAS基因染色體定位，發(fā)現(xiàn)16個GRAS基因聚集在5號染色體末端極小的一段區(qū)域內，且都屬于LISCL亞族，因此可以推測這段局域可能發(fā)生過小規(guī)?；驈椭剖录叭搜芯勘砻?，玉米GRAS家族也曾發(fā)生類似事件[5]。70%的高粱GRAS轉錄因子的內含子丟失，此現(xiàn)象在F-box與SAUR等大型基因家族中也經常發(fā)生，真核生物將出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因歸結于無內含子基因復制、無內含子基因逆轉錄以及水平基因轉移。此外，在進化過程中高粱GRAS轉錄因子存在6對直系同源基因，這些基因的理化性質、基因結構和基因表達均極其相似。

根據GO和KEGG注釋，發(fā)現(xiàn)高粱GRAS基因全部注釋到種子休眠調控，并且大多參與激素信號轉導通路。赤霉素是植物體內最重要的激素之一，對植物生長、種子萌發(fā)以及提高產量有重要意義，烯效唑是赤霉素合成抑制劑，對赤霉素起負向調控作用[27]。前人多項研究表明，GRAS轉錄因子可以參與赤霉素代謝通路[28]，影響植株正常發(fā)育，如擬南芥中AtGAI可以參與并影響GA代謝通路[9]；DELLA與SCL3蛋白對SHR/SCR復合體的調控作用，揭示了GRAS轉錄因子保持植物體內赤霉素穩(wěn)態(tài)的代謝過程，從而維持根系正常生長發(fā)育[29]。

基因的表達模式在一定程度上決定著基因功能，GRAS基因家族功能十分廣泛，除上述與激素調節(jié)相關外，水稻LISCL亞族的OsGRAS23轉錄因子可以受到一些應激反應基因誘導，正向調控水稻抗旱性[30]；逆境下抗霉素A與L-半胱氨酸等通過誘導LISCL亞族NtGRAS1上調表達，進而增加細胞內活性氧含量，參與脅迫應答[31]，水稻GRAS家族基因D26可以通過參與調控油菜素內酯代謝途徑，進而調控水稻分蘗生成[32]。結合轉錄組數據，80個高粱GRAS基因根據表達變化可以分為5組，其中III組GRAS基因最多，部分基因的表達量變化差異十分顯著，如SbGRAS15在14 d時基因表達量明顯上調，且處理組表達量顯著高于對照組，說明該基因可能參與激素調控網絡。挑選出8個具有顯著差異的高粱GRAS基因進一步通過q-PCR驗證，結果發(fā)現(xiàn)存在4個上調基因和1個下調基因，說明這些GRAS基因可能在高粱烯效唑的處理下發(fā)揮某種作用，這些基因在對外源生長調節(jié)劑的響應機制有待進一步研究。