張存存，鎖 然，劉亞瓊，王文秀，王浩燃，馬勝濤，王 頡

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院,河北 保定 071001；2.石家莊郵電職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050022）

雜色蛤（Ruditapes variegata）是我國沿海主要的貝類之一，山東青島、福建沿海、渤海產(chǎn)量較多。雜色蛤可食部位營養(yǎng)價值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素和維生素（VA、VD、煙酰胺及VB12等）及多不飽和脂肪酸等其他營養(yǎng)成分，是均衡飲食的重要組成部分[1-2]。但由于雜色蛤捕撈后貯藏不當極易腐爛，可將其加工為即食產(chǎn)品，這不僅可以豐富貝類水產(chǎn)品的種類，還可以降低水產(chǎn)品損失率，同時滿足生產(chǎn)者和消費者的要求。

即食雜色蛤是經(jīng)反壓高溫殺菌處理得到的1種即食帶殼原汁原味的真空軟包裝方便食品。產(chǎn)品剛加工完成時，味道鮮美，在常溫條件下隨著貯藏時間的延長，風味變淡，品質(zhì)下降。目前關于即食水產(chǎn)品研究多集中在加工工藝及品質(zhì)變化等方面[2-6]，而不同貯藏條件對即食雜色蛤理化指標影響的報道相對較少。本研究以即食雜色蛤為原料，研究了不同貯藏溫度（-18、0、5、25和35℃）對產(chǎn)品的理化特性和蛋白質(zhì)變化的影響，為即食雜色蛤的產(chǎn)后貯藏及品質(zhì)控制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

即食雜色蛤原料產(chǎn)地：遼寧興城海域；即食雜色蛤由河北省秦皇島市海東青食品有限公司提供；

試劑：TCA、EDTA、TBA、氯仿、DTNB、DNPH、鹽酸胍、無水乙醇、乙酸乙酯，以上試劑均為分析純，天津市天力化學試劑有限公司；甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京雷根生物技術有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

色彩色差計，日本柯尼卡美能達公司；TMSPRO型物性分析儀，美國FTC公司；K1100全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；臺式高速冷凍離心機，湖南易達京華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 即食雜色蛤加工工藝流程：雜色蛤捕撈后立刻運往工廠，在加工車間水池暫養(yǎng)48 h完成吐沙，經(jīng)過篩選、清洗、瀝干過程后裝袋，每袋為（30.0±2.0） g，真空包裝，隨后經(jīng)金屬檢測后進行121 ℃，0.2 MPa的高溫高壓殺菌操作，待即食雜色蛤冷卻后方可裝箱保存。

1.3.2 色澤的測定 采用CR-400色彩色差計對即食雜色蛤蛤肉的L*、a*、b*進行測定。CIELab表色系統(tǒng)將顏色數(shù)值化為L*、a*和b*。按照色彩色差計使用說明進行操作，先進行白板校正，再對30個樣品進行測定。

1.3.3 質(zhì)構的測定 采用TMS-PRO型物性分析儀對雜色蛤腹部進行2次壓縮做質(zhì)構剖面分析（Texture Profile Analysis，TPA分析）。測試條件設置為：平底柱形p/5探頭，測試據(jù)平面高度10 mm，測試速度30 mm/min，形變量50%，感應力0.5 N，壓縮間隔時間0 s。每次對30個樣品進行測定。

1.3.4 pH的測定 參照《GB 5009.237-2016食品安全國家標準 食品pH值的測定》中的酸度計法測定樣品pH值。

1.3.5 TVB-N含量的測定 參考《GB 5009.228-2016 食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法采用自動凱氏定氮儀測定即食雜色蛤中TVB-N含量。

1.3.6 TBA的測定 參考胡玥等[7]的方法測定樣品中脂肪氧化值。

1.3.7 游離巰基值的測定 參考Morzel等[8]修改的Ellman法測定游離巰基值含量。稱取2.00 g待測蛤肉，加入 10 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH 8.0），勻漿，3 500 r/min離心 10 min得上清液即為蛋白提取液。取1 mL上清液于試管中，稀釋10倍，加20 μL 0.002 mol/L DTNB 試劑，渦旋混勻后于 25 ℃條件下避光水浴1 h，結束后于412 nm波長處測其吸光度。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取液中蛋白含量。試驗重復3次。游離巰基值結果按式（1）計算：

式中：X為蛋白羰基值，單位為nmol羰基/mg蛋白；A為溶液吸光值；a為羰基分子吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)；b為光在樣本中經(jīng)過的距離，單位cm，本方法中b=1；c為蛋白濃度，單位mg/mL；106為計算結果換算為nmol羰基/mg蛋白的換算系數(shù)。

1.3.8 蛋白羰基值的測定 參考Mercier Y等[9]和胡呂霖[9]的方法稍作修改。采用DNPH比色法測定即食雜色蛤中蛋白羰基值。準確稱取2.00 g待測蛤肉，加入 10 mL 0.02 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.5）（含 0.6 mol/L 的 NaCl），勻漿，13 000 r/min 離心10 min得上清液即為蛋白提取液。

取 400 μL 上清液于 EP 管中，加 200 μL 2 mol/L的 HCl（含 0.01 mol/L DNPH），渦旋混勻，30 ℃避光水浴1 h（每10 min 渦旋1次）。結束后向EP管內(nèi)加入1 mL 40%的TCA，渦旋混勻靜置30 min沉淀蛋白。隨后 13 000 r/min 離心 15 min，留沉淀，再加入1 mL體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇溶液，渦旋，13 000 r/min 離心 10 min，以除去多余的DNPH，多次重復洗滌沉至上清液為無色。取沉淀加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，渦旋以溶解蛋白。待沉淀完全溶解后于370 nm波長處測其吸光度。蛋白羰基值結果按式（2）計算：

式中：X為蛋白羰基值，單位為nmol羰基/mg蛋白；A為溶液吸光值；a為羰基分子吸光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)；b為光在樣本中經(jīng)過的距離，單位cm，本方法中b=1；c為蛋白濃度，單位mg/mL；106為計算結果換算為nmol巰基/mg蛋白的換算系數(shù)。

1.4 試驗設計

將即食雜色蛤設 -18、0、5、25和 35 ℃ 5個溫度進行貯藏，其中-18 ℃處理每30 d，0、5和25 ℃處理每 15 d，35 ℃處理每 10 d 取樣進行色澤、質(zhì)構、pH、TVB-N含量、TBA、游離巰基值和蛋白羰基值進行測定，試驗重復3次。

1.5 試驗結果統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 25（IBM）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和方差分析，P< 0.05時為顯著性差異。采用Origin 2018版軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 色澤變化分析

色澤在產(chǎn)品的外觀和接受度中起著重要作用，直接影響著消費者對產(chǎn)品的喜好程度。一般來說，在產(chǎn)品中貯藏過程中，由于蛋白的氧化變性、脂質(zhì)氧化和色素降解過程都會造成顏色發(fā)生變化。即食雜色蛤貯藏過程中色澤L*、a*和b*變化如圖1所示。

圖1 即食雜色蛤貯藏過程中L＊、a＊和b＊變化Fig. 1 Changes of L＊、a＊ and b＊ in ready-to-eat variegated clams during storage

即食雜色蛤貯藏過程中色澤L*變化如圖1(a)所示，從圖可見，與-18 ℃凍藏組相比，0、5、25和35 ℃ 4個溫度L*顯著下降，且35 ℃貯藏下變暗速度最快，25、5和0 ℃次之，-18 ℃最慢，表明即食雜色蛤在高溫貯藏下，顏色變化更加顯著，Li等[11]發(fā)現(xiàn)即食對蝦在貯藏過程中L*下降，這與本研究的結果相似。這表明較高的貯藏溫度會加速雜色蛤自身的褐變。隨貯藏時間的延長，肌肉中的脂質(zhì)氧化物、蛋白發(fā)生非酶促褐變以及氧化反應均會導致變色，使L* 值下降[12]。

從圖1(b)，即食雜色蛤紅綠值在整個貯藏過程中整體呈先上升后下降的趨勢，其中35 ℃貯藏變化最為明顯。經(jīng)差異性分析，-18和0 ℃兩組之間沒有顯著性差異，其他溫度組之間均存在顯著性差異（P< 0.01）。即食雜色蛤貯藏過程中，肌紅蛋白發(fā)生變性，亞鐵肌紅蛋白變成高鐵肌紅蛋白，使即食雜色蛤在貯藏后期紅度值降低[13]。

從圖1(c)可見，即食雜色蛤b*整體呈先下降后平穩(wěn)趨勢。在5個貯藏溫度結束時，25和35 ℃與其他3個溫度之間存在顯著性差異（P< 0.05），-18、0和5 ℃ 3個貯藏溫度之間無明顯差異。黃色色素的形成可能是由于脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與磷脂中的胺或蛋白質(zhì)中的胺發(fā)生非酶褐變[12]。

綜合L*、a*、b* 3個色澤指標變化表明即食雜色蛤隨貯藏時間的延長，L*逐漸減小，a*在貯藏后期逐漸減小，b*在貯藏后期值逐漸增大，即食雜色蛤的顏色由乳白色變?yōu)樽攸S色，發(fā)生劣變。

2.2 質(zhì)構變化分析

水產(chǎn)品的質(zhì)地是評價其品質(zhì)好壞的重要指標之一，直接影響水產(chǎn)品的口感。貯藏期間產(chǎn)品的質(zhì)構受諸多因素影響，例如加工方式[10,14-15]、干制[16-17]及氧化反應[14,18]等。

硬度可以反應產(chǎn)品內(nèi)部結構的緊密程度。即食雜色蛤貯藏過程中硬度變化如圖2(a)所示，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，蛋白聚集可能會導致硬度上升，隨貯藏時間延長內(nèi)源作用導致蛋白質(zhì)降解、肌肉結構松散，從而使硬度又呈下降趨勢。-18 ℃凍藏和35℃高溫貯藏2組變化最為顯著，由3.70 N分別降至1.75和3.12 N，這可能是因為冷凍或高溫使蛋白質(zhì)發(fā)生變性或聚集作用，影響蛋白質(zhì)結構，從而影響即食雜色蛤的硬度。

圖2 即食雜色蛤貯藏過程中硬度和彈性變化Fig. 2 Changes of hardness and elasticity in ready-to-eat variegated clams during storage

即食雜色蛤貯藏過程中彈性變化如圖2(b)所示，所有貯藏溫度下彈性均隨時間延長彈性呈下降的趨勢，貯藏結束各組之間差異不顯著。即食雜色蛤貯藏初始彈性為1.874 mm，貯藏結束時分別為0.932 mm（-18 ℃ -180 d）、1.22 mm（0 ℃ -180 d）、1.18 mm（5 ℃ -180 d）、1.04 mm（25 ℃ -180 d）和 1.01 mm（35 ℃-90 d）。即食雜色蛤在0和5 ℃變化趨勢相對平緩，在-18和35 ℃貯藏的即食雜色蛤彈性下降比較迅速。所有溫度貯藏前后彈性均存在顯著差異性（P< 0.05），說明溫度對即食雜色蛤貯藏彈性有一定影響。

咀嚼性表示產(chǎn)品咀嚼到可以吞咽狀態(tài)時所做的功，可以反應產(chǎn)品的新鮮度，咀嚼性降低表明肌肉纖維喪失了其完整性，導致了肌肉間韌性的弱化[14]。即食雜色蛤貯藏過程中咀嚼性變化如表1所示，從表中可以看出，所有貯藏方式下咀嚼性均呈現(xiàn)下降趨勢，但貯藏前后差異性略有不同。5個貯藏溫度相比，0和5 ℃貯藏組咀嚼性下降相對其他貯藏組較為緩慢，經(jīng)過180 d貯藏前后樣品咀嚼性并無顯著性差異，而-18 ℃貯藏組樣品貯藏前后咀嚼性則存在極顯著差異（P< 0.01），表明即食雜色蛤適宜在冷藏條件（0～5 ℃）下貯藏能更好的保持產(chǎn)品咀嚼性。綜合以上3個質(zhì)構指標，表明即食雜色蛤適宜在冷藏條件（0～5 ℃）下貯藏，可更好的保持產(chǎn)品原本質(zhì)構特性。

表1 即食雜色蛤貯藏過程中咀嚼性變化Table 1 Changes of chewability in ready-to-eat variegated clams during storage

2.3 pH變化分析

水產(chǎn)品肌肉pH值的變化與其新鮮度密切相關，pH變化受諸多因素影響，如貯藏時間、貯藏溫度及本身的生理狀態(tài)等。即食雜色蛤貯藏過程中pH變化如圖3所示。從圖3可見，即食雜色蛤在貯藏過程中pH值在6.79～7.49范圍內(nèi)，除-18 ℃貯藏組外整體呈先上升后下降趨勢。35 ℃貯藏組最高pH值高于其他組，且達到最高pH值時間比其他組短，為30 d。使pH值變化的主要原因是貯藏期間內(nèi)源酶作用蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生堿類化合物使pH上升，后期肌肉中的糖原發(fā)生無氧酵解而積累更多的乳酸，從而使pH的下降[19]。-18 ℃貯藏組在整個過程呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，但貯藏前后不存在顯著性差異。

圖3 即食雜色蛤貯藏過程中pH變化Fig. 3 Changes of pH in ready-to-eat variegated clams during storage

2.4 TVB-N含量變化分析

揮發(fā)性鹽基氮（TNB-N）通常作為評價肉質(zhì)新鮮與否的重要指標，其含量越低，表明產(chǎn)品新鮮度越高。即食雜色蛤在不同溫度貯藏過程中TVB-N含量變化如圖4所示。從圖4可見，所有處理組的TVB-N含量變化均呈上升趨勢，且以35 ℃處理組上升速率最快，-18 ℃凍藏組最為緩慢。即食雜色蛤TVB-N含量初始值為1.39 mg/100 g，貯藏180 d 結束時 TVB-N 含量分別上升到 4.62 mg/100 g（-18 ℃）、8.39 mg/100 g（0 ℃）、10.29 mg/100 g（5 ℃）和 10.29 mg/100 g（25 ℃），35 ℃ 貯 藏90 d 升至 12.35 mg/100 g，經(jīng)差異性分析得，5 和25 ℃2個貯藏溫度之間無差異，與其他3個溫度之間均存在顯著性差異（P< 0.01）。由此可以看出，-18 ℃凍藏可減緩TVB-N含量的變化，貯藏即食雜色蛤效果較好。揮發(fā)性鹽基氮升高的原因是由于酶的分解作用使產(chǎn)品蛋白質(zhì)發(fā)生分解產(chǎn)生了含氨、氮和硫等揮發(fā)性物質(zhì)。即食雜色蛤在-18、0和5 ℃溫度下貯藏30 d與初始品質(zhì)差異不顯著，與GB 2733-2015 限值 30 mg/100 g 相比，即食雜色蛤在 -18、0、5 和 25 ℃貯藏 180 d，在 35 ℃貯藏 90 d時均未超標，仍可安全食用。

圖4 即食雜色蛤貯藏過程中TVB-N含量變化Fig. 4 Changes of TVB-N content in ready-to-eat variegated clams during storage

2.5 TBA變化分析

硫代巴比妥酸值（TBA）與肉類脂肪氧化程度有很強的相關性。TBA值越大，說明脂肪的氧化程度越高，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)（醛、酮、酸等）也就越多，脂肪酸敗就越嚴重，因此廣泛用于肉產(chǎn)品品質(zhì)評價中反應脂類氧化的常用指標。

即食雜色蛤在整個貯藏過程中硫代巴比妥酸（TBA）值變化如圖5所示。從圖5可見，TBA值均隨貯藏時間延長呈上升趨勢，本研究結果變化趨勢與之前研究結果[20]相似。即食雜色蛤貯藏開始時 TBA 值為 1.564 mgMDA/100 g，貯藏 180 d 結束時，-18、0、5和25 ℃貯藏條件下分別上升至2.212、5.850、6.210 和 7.237 mgMDA/100 g，35 ℃貯藏到90 d 時上升至 9.913 mgMDA/100 g，由此可以看出，0和5 ℃貯藏沒有顯著差異，但與其他3個溫度均存在顯著性差異（P< 0.05），35 ℃貯藏即食雜色蛤脂肪氧化最為迅速，-18 ℃凍藏可減緩TBA的變化速率，可有效減緩脂肪氧化速率。TBA隨貯藏時間延長而升高的原因可能是前期加工過程和后期貯藏期間細胞結構被破壞，使不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的丙二醛含量增加，從而TBA增加。另外，即食雜色蛤富含多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)，更容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而導致產(chǎn)品品質(zhì)下降[21]。

圖5 即食雜色蛤貯藏過程中硫代巴比妥酸值變化Fig. 5 Changes of TBA value in ready-to-eat variegated clams during storage

2.6 游離巰基值變化分析

游離巰基值多用于反應蛋白氧化程度，巰基含量越低，說明蛋白氧化程度越高。即食雜色蛤貯藏過程中游離巰基值變化如圖6所示，整體呈下降趨勢，但0、5和25 ℃貯藏組30 d前呈上升趨勢，而隨后呈下降趨勢。即食雜色蛤初始游離巰基值為24.26 nmol巰基 /mg蛋白，貯藏 180 d結束時，其值分別降至21.75 nmol巰基/mg蛋白（-18 ℃）、17.69 nmol巰基 /mg 蛋白（0 ℃）、16.68 nmol巰基 /mg蛋白（5 ℃）和 16.37 nmol巰基 /mg蛋白（25℃），35 ℃貯藏到90 d降至13.65 nmol巰基/mg蛋白，分別下降了10.35%、27.08%、31.24%、32.52%和43.73%。35 ℃貯藏組均與其他溫度組存在顯著差異性（P< 0.01），180 d 貯藏結束時，0、5 和 25 ℃3個貯藏組差異性不顯著，但均與-18 ℃貯藏組存在顯著性差異（P< 0.01）。

圖6 即食雜色蛤貯藏過程中游離巰基值變化Fig. 6 Changes of free sulfhydryl value in ready-to-eat variegated clams during storage

即食雜色蛤在0、5和25貯藏到30 d時，游離巰基值均達到最大值，隨后又呈下降趨勢，導致最大值出現(xiàn)的原因可能是因為含硫氨基酸（半胱氨酸與甲硫氨酸）經(jīng)自由基氧化反應生成多種氧化產(chǎn)物（如二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物），二硫鍵斷裂導致巰基含量增高[22]，而后隨貯藏時間延長巰基則又氧化導致含量下降[10]。5個貯藏溫度相比，-18 ℃凍藏組更能減小即食雜色蛤貯藏過程中的蛋白氧化程度。

2.7 蛋白羰基值變化分析

蛋白羰基化是蛋白氧化的顯著特征之一。本試驗采用傳統(tǒng)的2，4-二硝基苯肼（DNPH）法測定即食雜色蛤蛤肉中蛋白羰基值。即食雜色蛤貯藏過程中蛋白羰基值變化如圖7所示，從圖7可見，即食雜色蛤在貯藏過程中均呈上升趨勢，但不同貯藏溫度蛋白羰基值變化有所不同，說明不同溫度貯藏過程中，蛋白也發(fā)生了不同程度的氧化，且貯藏溫度越低，蛋白氧化程度越低。最初蛋白羰基值為3.188 nmol羰基/mg蛋白，貯藏180 d結束時其值分別為 3.550 nmol羰基 /mg 蛋白（-18 ℃）、6.093 nmol羰基/mg蛋白（0 ℃）、7.149 nmol羰基/mg蛋白（5 ℃）、8.164 nmol羰基 /mg 蛋白（25 ℃），而35 ℃貯藏 90 d 則上升至 6.042 nmol羰基 /mg 蛋白，此值升高原因可能是由于肌肉組織破裂的細胞器釋放了氧化酶和氧化劑導致，這些過程通常與肌肉蛋白質(zhì)功能的下降有關，導致水分流失增加，蛋白質(zhì)凝膠變?nèi)?，另一方面可能是由于含?cè)鏈殘基的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸與脯氨酸等）存在，其被氧化而引入羰基基團[10]。從此指標可以看出，溫度越低，蛋白氧化程度越小，越有利于即食雜色蛤的貯藏。

圖7 即食雜色蛤貯藏過程中蛋白羰基值變化Fig. 7 Changes of protein carbonyl value in ready-to-eat variegated clams during storage

3 結果與討論

通過測定即食雜色蛤在不同溫度（-18、0、5、25和35 ℃）下貯藏期間理化特性變化，發(fā)現(xiàn)5個溫度下貯藏前后各指標均存在顯著性差異，隨貯藏時間延長，即食雜色蛤L*、彈性和咀嚼性呈下降趨勢，TVB-N含量、TBA和菌落總數(shù)呈上升趨勢，a*、硬度和pH呈先上升后下降趨勢，b*則先下降后趨于平穩(wěn)，即食雜色蛤各指標在貯藏前后均存在顯著性差異。以TVB-N含量為評價指標，即食雜色蛤在-18、0和5 ℃溫度下貯藏30 d與初始品質(zhì)差異不顯著，考慮其安全性在-18、0、5和25 ℃貯藏180 d，在35 ℃貯藏90 d時均未超標，仍可安全食用。這不僅為即食雜色蛤加工貯藏提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，同時也為開發(fā)新的即食水產(chǎn)品奠定了基礎。