郭丹丹 于思明 李佳卓 許文婷 董柏涵

（黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

化療是腫瘤治療方案的基石，其治療藥物蒽環(huán)類藥物的心臟毒性與藥物的累積劑量有關，阿霉素累積劑量400、550、700 mg/m2時，心功能不全的發(fā)生率分別為3%～5%、7%～26%、18%～48%［1-2］。線粒體融合蛋白［Mitofusin 1（Mfn1）、Mitofusin 2（Mfn2）］是心衰心肌損傷的靶點，已有多項缺血再灌損傷領域的研究顯示線粒體融合蛋白在治療中的作用：在HL-1細胞中高表達Mfn1或Mfn2能夠通過抑制線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）的開放進而減少心臟I/R細胞凋亡［3］；敲除小鼠心肌Mfn1/Mfn2基因也能夠降低mPTP開放、線粒體Ca2+超載和ROS的生成，保護急性缺血心?。?］。現(xiàn)代中醫(yī)認為心衰的病機主要是本虛標實［5-6］。燧心膠囊溫腎助陽、引火歸元、化氣行水，研究發(fā)現(xiàn)其能通過改善線粒體動力學來調控細胞穩(wěn)態(tài)［7-8］，防治蒽環(huán)類藥物所致心力衰竭，但具體機制尚未明確。本研究擬探討基于“引火歸元”理論的燧心膠囊對心衰大鼠線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2表達的影響，為蒽環(huán)類藥物所致心力衰竭的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SD大鼠，清潔級，體質量（200±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SYXK（黑）2016004，按黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級操作規(guī)程進行飼養(yǎng)。大鼠在12 h明暗周期環(huán)境中飼養(yǎng)，并飼喂標準飲食（10%脂肪、20%蛋白質和70%碳水化合物）和純凈水。

1.2 實驗藥物

燧心膠囊（由制附子、紅參、丹參、茯苓、白術、澤瀉組成，黑龍江中醫(yī)藥大學附屬二院制劑室制備，去掉膠囊皮，用蒸餾水溶解后制成生藥含量0.27、0.54、1.08 g/mL的備用液）。纈沙坦（德國默克生物科技，SA-87458）。

1.3 試劑與儀器

GEvid7超聲心動圖系統(tǒng)（美國通用），阿霉素（ADR，德國默克生物科技，SF-8766.63），TRIzol試劑（Invitrogen，批號：YT-4741.63），M-MLV逆轉錄酶（美國 Clontech，批號：XS-4785.63），SsoFastTMEvaGreen Supermix（美國Bio-Rad Laboratories，批號：CD-7485.63），裂解緩沖液（德國Roche Applied Science，批號：WS-4152.36），BCA蛋白測定試劑盒（美國Thermo Scientific，批號：DF-4745.96），十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（塞蘭伯生物科技，批號：DF-74585.96），聚偏二氟乙烯（PVDF，美國Sigma，批號：xs-4758.63），Mfn1、Mfn2 一抗（1∶1 000、1∶2 000；Abcam，批號 ：WS2569.63、RF5874.66），GAPDH 一抗（1∶1 000；Cell Signaling Technology，批號：47485.63），HRP二級抗體（1∶5 000；GE Healthcare，Buckinghamshire，批號：XS-745.96），增強化學發(fā)光試劑（ECL，Beyotime生物技術研究所，WE-6963.63）。

1.4 造模與給藥

60只大鼠根據(jù)體質量隨機分成6組：對照組、模型組、纈沙坦組和燧心膠囊低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。模型組、纈沙坦組、燧心膠囊低中高劑量組大鼠采用阿霉素構建慢性心衰大鼠模型，將阿霉素用生理鹽水配制成2.0 mg/mL溶液，以2 mL/kg體質量腹腔注射，1次/周，連續(xù)6周，累積總量24 mg/kg，每次注射前均重新測量體質量作為該次用藥劑量的計算標準，經超聲心動圖檢測確定造模是否成功，當模型組LVIDd、LVIDs、FS高于對照組，EF低于50%，則說明模型建立成功。建模成功后第2天，纈沙坦組予纈沙坦7.2 mg/（kg·d）；燧心膠囊低、中、高劑量組依次灌胃給予2.7、5.4、10.8 g/kg的燧心膠囊。各組均等容積灌胃給藥，1 mL/10 g體質量，每日2次。本次實驗周期為4周，對照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。

1.5 超聲心動指標測定

末次給藥后1 d，大鼠麻醉后平臥位固定，將探頭置于胸骨左緣，取左室長軸最大直徑處，M型超聲標記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內膜位置，隨機攜帶軟件自動計算短軸縮短分數(shù)（FS），左心室內舒張期尺寸（LVIDd），左心室內收縮期尺寸（LVIDs）和射血分數(shù)（EF%）。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 血清ADP、ATP含量檢測 末次給藥后1 d，大鼠在麻醉狀態(tài)下行腹主動脈采血，靜置、離心后取上清置于-80℃冰箱保存。用ELISA法檢測血清ATP、ADP含量，繪制標準曲線測定。

1.6.2 心肌線粒體結構電鏡病理觀察 常規(guī)脫水透明、浸蠟包埋、脫蠟制作心肌病理切片，經鋨酸固定30 min，醋酸鈾/枸櫞酸鉛染色后，電鏡觀察心肌線粒體結構。

1.6.3 逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）測定Mfn1、Mfn2 mRNA水平 使用TRIzol試劑從心肌組織中提取總RNA，M-MLV逆轉錄酶將5 μg總RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR 的最終體積為 10 μL，其中包含 5 μL Sso-FastTMEvaGreen Supermix，1 μL cDNA（1∶50稀釋）以及2 μL正向和反向引物（1 mm）。PCR步驟如下：聚合酶在95℃激活30 s，35個擴增循環(huán)，每個循環(huán)為95℃5 s，60 ℃ 20 s和1個解離，包括95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s和95℃15 s。將結果標準化為GAPDH蛋白表達，使用DCt方法確定目標基因的相對定量。

1.6.4 蛋白質印跡分析心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2蛋白水平 蛋白酶的裂解緩沖液裂解心肌組織，在14 000 r/min下離心20 min后，收集上清液。使用BCA蛋白測定試劑盒來測量總蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（6%～15%）分離細胞蛋白的等分試樣（50 μg），然后電轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h。然后將膜與Mfn1、Mfn2蛋白質的一抗孵育，以進行蛋白質印跡分析；GAPDH與相應的二抗一起孵育后，通過增強的化學發(fā)光檢測免疫反應帶。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較

見表1。治療后模型組大鼠LVIDd、LVIDs水平高于對照組，F(xiàn)S、EF水平低于對照組（P＜0.05）；纈沙坦組和燧心膠囊低、中、高劑量組LVIDd、LVIDs水平低于模型組，F(xiàn)S、EF水平高于模型組（P＜0.05），且隨著燧心膠囊劑量的增加，LVIDd、LVIDs水平逐漸降低，F(xiàn)S、EF水平逐漸升高（P＜0.05）；燧心膠囊低、中劑量組LVIDd、LVIDs水平高于纈沙坦組，F(xiàn)S、EF水平低于纈沙坦組（P＜0.05）；燧心膠囊高劑量組與纈沙坦組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與纈沙坦組比較，△P＜0.05；與燧心膠囊低劑量組比較，▲P＜0.05；與燧心膠囊中劑量組比較，◇P＜0.05。下同。

組別對照組模型組纈沙坦組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 10 10 10 10 10 10 LVIDd（mm）5.98±0.39 8.59±0.40*5.47±0.42#7.93±0.42#△6.51±0.44#△▲5.67±0.45#▲◇LVIDs（mm）2.85±0.48 7.93±0.63*4.28±0.45#6.36±0.48#△5.62±0.42#△▲4.18±0.44#▲◇FS（%）53.52±3.65 24.97±3.41*46.41±3.33#30.86±3.25#△36.86±3.41#△▲45.41±3.44#▲◇EF（%）79.52±5.26 41.45±5.41*63.29±5.39#46.99±6.41#△53.99±5.41#△▲63.01±5.25#▲◇

2.2 各組大鼠血清ADP、ATP水平比較

見表2。治療后模型組大鼠ADP水平高于對照組，ATP水平低于對照組（P＜0.05）；纈沙坦組和燧心膠囊低、中、高劑量組ADP水平低于模型組，ATP水平高于模型組（P＜0.05），且隨著燧心膠囊劑量的增加，ADP水平逐漸降低，ATP水平逐漸升高（P＜0.05）；燧心膠囊低、中劑量組ADP水平高于纈沙坦組，ATP水平低于纈沙坦組（P＜0.05）；燧心膠囊高劑量組與纈沙坦組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清ADP、ATP水平比較（μg/L，±s）

表2 各組大鼠血清ADP、ATP水平比較（μg/L，±s）

組別對照組模型組纈沙坦組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 10 10 10 10 10 10 ADP 3 212.85±13.48 4 257.93±15.63*3 584.28±20.45#3 996.66±18.48#△3 741.63±16.42#△▲3 599.63±15.44#▲◇ATP 745.98±10.39 358.59±11.40*654.36±13.42#458.96±14.42#△556.51±13.44#△▲659.63±14.45#▲◇

2.3 各組大鼠心肌病理結構觀察

對照組心肌線粒體結構正常，排列整齊，無腫脹、無線粒體嵴模糊以及斷裂。模型組心肌線粒體結構明顯異常，排列錯亂，線粒體嵴模糊甚至斷裂，線粒體膜破裂，纈沙坦及高劑量燧心膠囊干預后，情況明顯好轉，線粒體數(shù)目增多，線粒體嵴清晰可見，而低、中劑量燧心膠囊干預后，心肌線粒體仍有輕微損傷，可見線粒體輕度腫脹，線粒體嵴顯示略清晰，見圖1。

2.4 各組大鼠心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平比較

見表3，圖2。治療后模型組大鼠心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平低于對照組（P＜0.05）；纈沙坦組和燧心膠囊低、中、高劑量組心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平高于模型組（P＜0.05），且隨著燧心膠囊劑量的增加，心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平逐漸升高（P＜0.05）；燧心膠囊低、中劑量組心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平低于纈沙坦組（P＜0.05）；燧心膠囊高劑量組與纈沙坦組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA及蛋白水平比較（±s）

組別對照組模型組纈沙坦組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 10 10 10 10 10 10 Mfn1 mRNA 6.92±0.37 0.96±0.38*4.56±0.33#2.35±0.35#△3.48±0.35#△▲4.57±0.37#▲◇Mfn2 mRNA 5.08±0.36 0.93±0.37*4.63±0.32#2.41±0.35#△3.60±0.39#△▲4.61±0.40#▲◇Mfn1蛋白2.12±0.14 0.35±0.15*1.26±0.16#0.65±0.15#△0.98±0.14#△▲1.27±0.13#▲◇Mfn2蛋白2.15±0.11 0.48±0.10*1.36±0.14#0.71±0.13#△1.01±0.17#△▲1.34±0.15#▲◇

圖2 各組大鼠心肌Mfn1、Mfn2蛋白水平表達

3 討論

蒽環(huán)類藥物所致心力衰竭的防治與一般性心衰不同，必須兼顧藥毒、腫瘤特性與心陽不足3個要素，如僅執(zhí)一端，則療效往往不能令人滿意。心力衰竭的關鍵在于心陽不振，鼓動無力。中醫(yī)學的“引火歸元”理論在此時具有比較重要的指導意義，補陽而不壅滯，在補陽的同時減少腫瘤對陽氣的攝入，并使“妄火”隨水趨下，“導龍入?！保顾鹣酀?，有利于維持患者的陰陽平衡［9-11］。燧心膠囊為黑龍江中醫(yī)藥大學國家級名老中醫(yī)李延教授經驗方，方中以制附子為君，既補心火，又助腎陽；紅參大補元氣，復脈固脫，益氣安神［12］。正如《刪補名醫(yī)方論》中所謂“能瞬息化氣于烏有之鄉(xiāng)，頃刻生陽于命門之內”。參附相配，不僅能夠協(xié)同增效，而且附子大毒可得人參制約，減毒減害［13］。熟地黃補腎水，麥冬滋肺陰，金水相生，水火既濟，各安本位。再以茯苓、白術、澤瀉導水趨下，使“妄火”隨之下行，歸于腎水。又佐以丹參活血養(yǎng)血，化瘀通絡，祛除痰濁、瘀血等病理產物，且能調暢氣機，從而達到陰平陽秘的平衡狀態(tài)。本研究結果顯示：纈沙坦組、燧心膠囊低、中、高劑量組LVIDd、LVIDs、ADP水平低于模型組，F(xiàn)S、EF、ATP水平高于模型組。這說明，燧心膠囊能明顯減輕心衰大鼠心肌損傷，改善心功能水平，這與上述討論一致。

阿霉素的心血管毒性機制為鐵介導的活性氧的產生及促進心肌的氧化應激；阿霉素螯合鐵離子后觸發(fā)氧自由基，尤其是羥自由基的生成，導致心肌細胞膜脂質過氧化和心肌線粒體DNA的損傷。心肌細胞富含線粒體，也是產生ROS的根源；阿霉素對于心磷脂的親和力較高，可進入線粒體，結合心磷脂從而抑制呼吸鏈，造成心臟損傷。本研究結果顯示：對照組心肌線粒體結構正常，排列整齊，無腫脹、無線粒體嵴模糊以及斷裂；模型組心肌線粒體結構明顯異常，排列錯亂，線粒體嵴模糊甚至斷裂，線粒體膜破裂，纈沙坦及高劑量燧心膠囊干預后，情況明顯好轉，線粒體數(shù)目增多，線粒體嵴清晰可見，而低、中劑量燧心膠囊干預后，心肌線粒體仍有輕微損傷，可見線粒體輕度腫脹，線粒體嵴顯示略清晰。這提示，燧心膠囊對阿霉素引起的心肌線粒體損傷具有明顯抑制作用，其高劑量效果與纈沙坦相似。

線粒體為保持正常生理功能，不斷進行動態(tài)變化，稱為線粒體動力學，主要包括線粒體融合與分裂兩個過程。線粒體融合過程由融合蛋白調節(jié)，如Mfnl、Mfn2。Mfn1、Mfn2具有很強的結構和功能相似性。Mfn1對活性氧自由基具有抵抗力［14］。線粒體外膜和內膜的融合受Mfn1蛋白切割調控。為此，將胞質Mfn1導入線粒體，分別產生長和短異構體Mfn1L和Mfn1S。據(jù)報道，由于超氧化物歧化酶2（SOD2）水平降低，Mfn1突變會增加對氧化應激的敏感性［15］。最近，心肌細胞中Mfn1表達降低的突變小鼠表現(xiàn)出鈣積累增加，這延遲了通透性轉變孔的開放，并且還增加了其對血流動力學壓力的敏感性［16］。在其他研究中，Mfn1的缺失導致線粒體融合受損，因此片段化可引發(fā)線粒體自噬和細胞死亡。Mfn2基因敲除小鼠（Mfn2-KO）出現(xiàn)線粒體片段化，加重ROS引起的線粒體功能障礙；在另一項研究中，缺血-再灌注損傷導致Mfn2的基因低表達，進而出現(xiàn)線粒體和心臟功能障礙［17］。Mfn2能調節(jié)線粒體的結構和代謝，在糖尿病和肥胖癥中Mfn2表達降低，并隨著體質量減輕和運動增加而增加［18］。本研究中，纈沙坦組和燧心膠囊低、中、高劑量組心肌線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA和蛋白水平高于模型組。結合前述討論說明，燧心膠囊能促進線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA和蛋白水平進而減輕線粒體功能障礙。

綜上所述，燧心膠囊對阿霉素所致大鼠心衰及心肌線粒體損傷具有抑制作用，其機制可能與燧心膠囊能促進線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2 mRNA和蛋白水平表達有關。