馬登磊 李延崢,2 祝艷秋 李 林 張 蘭*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053； 2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北唐山 063000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著年齡的增加，AD的患病率增高，其中65歲以上人群中AD的患病率約為5%，70歲以上為10%，80歲以上則高達(dá)30%[1]。老化對(duì)疾病的發(fā)生和進(jìn)展影響很大，是AD發(fā)病最重要的危險(xiǎn)因子。AD等神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和進(jìn)展等多個(gè)過程均與衰老有關(guān)，通過延緩腦及機(jī)體的衰老而預(yù)防和治療AD將可能減輕AD患者的患病負(fù)擔(dān)[2]。

快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)是由京都大學(xué)在AKR/J系小鼠繁育過程中發(fā)現(xiàn)的具有快速老化特征的小鼠品系。SAMP8小鼠表現(xiàn)不可逆的快速老化，表現(xiàn)與老年人和AD患者類似的老化癥狀，例如壽命減低、記憶障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、突觸丟失、Aβ及tau蛋白病變等[3-4]。

傳統(tǒng)中藥山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的作用。山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是山茱萸中的有效部位。筆者[5]的前期研究顯示，CIG能夠改善創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠的認(rèn)知功能及tau蛋白磷酸化。此外，研究[6-7]顯示CIG可以改善不同月齡的SAMP8小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及tau蛋白的過度磷酸化，以上結(jié)果提示CIG在老化及AD中的潛在價(jià)值。但是CIG在SAMP8小鼠上對(duì)AD相關(guān)的其他病理改變的藥理作用尚未完全闡明。因此，本研究擬應(yīng)用8月齡的SAMP8小鼠，進(jìn)一步研究藥物CIG對(duì)SAMP8小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)代謝相關(guān)蛋白及突觸相關(guān)蛋白的變化，從而進(jìn)一步探明CIG在老化及AD治療中的潛在價(jià)值和可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8月齡正常老化小鼠(senescence accelerated mouse/resistant 1,SAMR1)，雄性，24只；8月齡快速老化小鼠SAMP8，雄性，48只，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物分級(jí)為無特定病原體級(jí)(SPF)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室屏障系統(tǒng)中，自由進(jìn)食進(jìn)水，保持每日12 h/12 h光照周期控制，溫度控制20～25 ℃。所有飼養(yǎng)條件及操作規(guī)范按首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):0003474。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

CIG由宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制，為中藥山茱萸的有效部位。從山茱萸中提取和分離，獲得CIG，純度為70% (其中主要成分為莫諾苷和馬錢苷)。實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑量，溶解于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)，制成藥液應(yīng)用。陽性藥奧拉西坦膠囊(oxiracetam capsule)，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031033。適應(yīng)證：輕中度血管性癡呆、AD以及腦外傷等癥引起的記憶與智能障礙。

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)抗體(貨號(hào)2452)，識(shí)別突觸后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)抗體(貨號(hào)3409)，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體(貨號(hào)5174)，識(shí)別鈣調(diào)素依賴蛋白激酶IIα286位點(diǎn)蘇氨酸Thr磷酸化(phospho-calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,p-CamkIIα)抗體(貨號(hào)12716)：購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；識(shí)別可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble amyloid procurer protein α,sAPPα )抗體(貨號(hào)SIG-39139)：購(gòu)自美國(guó)Covance公司；識(shí)別去整合素金屬蛋白酶10 (a disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10) 抗體(貨號(hào)A2726)，識(shí)別突觸囊泡蛋白突觸體素(synaptophysin)抗體(貨號(hào)SAB4502906)：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；識(shí)別β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE-1 ) 抗體(貨號(hào)ab2077)、識(shí)別胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)抗體(貨號(hào)ab109538)、識(shí)別α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體R1亞基GluR1 (glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 1)抗體(貨號(hào)ab31232)、識(shí)別鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,CamkIIα)抗體(貨號(hào)ab22609)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

小鼠紅外自主活動(dòng)儀，BA-2小鼠避暗實(shí)驗(yàn)箱：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。Western blotting法電泳及電轉(zhuǎn)設(shè)備：美國(guó)Bio-Rad公司?；瘜W(xué)凝膠成像系統(tǒng)(Flour Chem HD2)：美國(guó)Protein Simple 公司。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

8月齡SAMR1共24只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為2組：SAMR1對(duì)照組，SAMR1+CIG低劑量組(100 mg/kg)，每組12只。8月齡SAMP8共48只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：SAMP8模型組、SAMP8+CIG低劑量組(100 mg/kg，M)、SAMP8+CIG高劑量組(200 mg/kg，H)、SAMP8+奧拉西坦組(360 mg/kg，Oxi)，每組12只。CIG灌胃給藥每日1次，共2個(gè)月，至10月齡。SAMR1對(duì)照組、SAMP8模型組灌胃給予同體積生理鹽水。

1.4 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

在給藥2個(gè)月后，應(yīng)用自主活動(dòng)測(cè)試儀對(duì)SAMP8小鼠進(jìn)行自主活動(dòng)測(cè)試。將小鼠放入自主活動(dòng)箱內(nèi)，蓋上箱蓋，讓小鼠適應(yīng)3 min后，使用電腦程序控制實(shí)驗(yàn)開始，箱體內(nèi)的紅外感應(yīng)自動(dòng)記錄小鼠的活動(dòng)，計(jì)數(shù)5 min內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。

1.5 避暗實(shí)驗(yàn)

避暗實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物趨暗的特性而設(shè)計(jì)的檢測(cè)被動(dòng)回避記憶能力的行為學(xué)方法[8]。實(shí)驗(yàn)裝置分為明暗兩室，明室有燈照射，暗室底部有通電銅柵，兩室間有小門連接。訓(xùn)練時(shí)將動(dòng)物放置在明室，因其嗜暗的特性鉆入暗室，此時(shí)動(dòng)物接受電擊獲得記憶。記錄小鼠在第2次訓(xùn)練24 h后首次進(jìn)入暗室的時(shí)間(步入潛伏期)。

1.6 Western blotting法檢測(cè)

每組4只小鼠，麻醉后取出腦，剝離出皮質(zhì)組織，放入-80 ℃保存。皮質(zhì)組織按照1∶10(mg∶mL)比例加入含有蛋白酶抑制劑的組織勻漿液，裂解后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱變性蛋白。用BCA法對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。取30～50 μg樣品，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS-PAGE凝膠電泳及電轉(zhuǎn)，蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))TBST脫脂奶粉封閉，分別與一抗(1∶1 000)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠或抗兔IgG抗體(二抗，1∶2 000) 孵育。加ECL發(fā)光液后，在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中得到蛋白條帶。用Multi Gauge V3.0軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析和統(tǒng)計(jì)，與GAPDH灰度比值后得到蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIG對(duì)SAMP8小鼠行為學(xué)的影響

在給藥2個(gè)月后對(duì)SAMP8小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，觀察CIG對(duì)模型小鼠衰老(自主活動(dòng))及認(rèn)知功能(避暗試驗(yàn))的影響。自主活動(dòng)記錄各種小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，避暗試驗(yàn)記錄小鼠在第2次訓(xùn)練24 h后首次進(jìn)入暗室的時(shí)間(步入潛伏期)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及步入潛伏期時(shí)長(zhǎng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，模型組小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)，而灌胃給予CIG(100、200 mg/kg)能夠顯著增加SAMP8小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)(P<0.05)。模型組小鼠步入潛伏期顯著降低(P<0.05)，而CIG(200 mg/kg) 給藥組可以顯著增加SAMP8小鼠的步入潛伏期(P<0.05，圖1)。

圖1 CIG對(duì)SAMP8小鼠自主活動(dòng)及避暗實(shí)驗(yàn)的影響Fig.1 Effects of CIG on locomotor activity and step-in latencyA: quantitative analysis of the number of locomotor activities; B: quantitative analysis of the step-in latency. #P<0.05, ##P<0.01 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg); CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.2 CIG對(duì)SAMP8小鼠皮質(zhì)APP相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)SAMP8小鼠APP、sAPPα 、ADAM10、BACE-1、IDE的表達(dá)。各組間SAMP8小鼠sAPPα、ADAM10、IDE表達(dá)濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而BACE-1、APP表達(dá)濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，SAMP8小鼠皮質(zhì)sAPPα、ADAM10和IDE的表達(dá)濃度顯著低于SAMR1組(P<0.05)。CIG給藥可以顯著增加SAMP8小鼠皮質(zhì)sAPPα、ADAM10和IDE的表達(dá)濃度(P<0.05，圖2)。

圖2 CIG對(duì)SAMP8小鼠皮質(zhì)APP相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of CIG on the expression of APP related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA: representative images of the expression of APP, sAPPα, ADAM10, BACE1 and IDE in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. GAPDH served as an internal loading control and the relative intensity in the SAMP8 model group was set as 1.0. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 group. Sal: normal saline (vehicle); APP: β-amyloid precursor protein; sAPPα: soluble APPα fragment; ADAM10: a disintegrin and metalloproteinase 10 (α-secretase); BACE-1: β-site APP cleaving enzyme (β-secretase); IDE: insulin-degrading enzyme; CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.3 CIG對(duì)SAMP8小鼠皮質(zhì)突觸相關(guān)蛋白的影響

各組間SAMP8小鼠大腦皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CaMKIIα表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，SAM8小鼠大腦皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。CIG給藥可以顯著增加SAMP8小鼠皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表達(dá)(P<0.05，圖3)。

圖3 CIG對(duì)SAMP8小鼠皮質(zhì)突觸相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effects of CIG on the expression of synaptic plasticity-related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA： representative images of the expression of synaptophysin, PSD95, GluR1, phosphorylated CamKIIα and total CamKIIα in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. Sal： normal saline (vehicle); PSD95： postsynaptic density protein 95; GluR1: AMPA receptor subunit 1; CamKIIα: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II α; p-CamKIIα: phosphorylated CamKIIα at Thr286; CIG: cornel iridoid glycoside; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg).

3 討論

SAMP8小鼠模型可以模擬由老化等多種因素引起的散發(fā)型AD的臨床和病理表現(xiàn)。SAMP8小鼠的老化速度，尤其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老速度，是SAMR1對(duì)照小鼠的近兩倍[9]。在4月齡時(shí)，SAMP8小鼠就開始表現(xiàn)出認(rèn)知功能的障礙，從7月齡開始SAMP8小鼠表現(xiàn)出跟年齡相關(guān)的運(yùn)動(dòng)障礙[3, 10]。本研究發(fā)現(xiàn)10月齡的SAMP8小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能的障礙，CIG給藥可以顯著改善10月齡SAMP8小鼠的認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)功能障礙，提示CIG在改善老化引起的AD中的藥理作用。

APP的異常剪切和Aβ沉積是AD的發(fā)病機(jī)制和病理表現(xiàn)之一。自6月齡起，SAMP8小鼠即表現(xiàn)出來了年齡相關(guān)性的Aβ沉積[11]。病理性的Aβ片段由APP在β-位點(diǎn)剪切酶BACE1和γ-位點(diǎn)剪切酶共同作用下生成[12]。而在健康大腦中，APP主要的剪切途徑是被α-位點(diǎn)剪切酶ADAM10作用，生成可溶性的APP片段sAPPα和C末端[13]。與之前的研究[14]結(jié)果一致，本研究中發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠腦內(nèi)ADAM10和sAPPα的表達(dá)水平顯著降低。研究[15]顯示，通過增加ADAM10的表達(dá)水平進(jìn)而降低腦內(nèi)Aβ沉積可以顯著改善SAMP8小鼠的病理表現(xiàn)和存活。本研究中，CIG可以顯著增加SAMP8小鼠腦內(nèi)ADAM10和sAPPα的水平，提示CIG可能通過增加APP在α-位點(diǎn)的剪切，進(jìn)而減少Aβ片段的形成。此外，IDE作為Aβ的降解酶，其表達(dá)的增加也可以改善Aβ沉積引起的病理改變[16]。因此，本研究認(rèn)為CIG可以通過增加ADAM10和IDE等代謝酶的表達(dá)，改善APP的剪切途徑，減少Aβ的形成。本研究中發(fā)現(xiàn)BACE-1在該月齡SAMP8小鼠的腦內(nèi)有增加的趨勢(shì)，CIG給藥有降低其表達(dá)的趨勢(shì)，這提示BCAE-1也可能參與Aβ的形成。

突觸是神經(jīng)系統(tǒng)的基本單元，在神經(jīng)元信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要的作用。本研究采用Western blotting法檢測(cè)了突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括突觸囊泡蛋白突觸體素(synaptophysin)、突觸后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)、GluR1、CaMKIIα及其在蘇氨酸(Thr)286位點(diǎn)磷酸化(p-CaMKIIα)的表達(dá)。突觸的可塑性參與學(xué)習(xí)和記憶形成的基本環(huán)節(jié)。Aβ片段聚集后可以產(chǎn)生毒性，可以損傷突觸的形態(tài)和正常的功能[17]。因此，SAMP8小鼠的一個(gè)特征病理表現(xiàn)就是突觸的丟失及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的降低[18]。突觸相關(guān)蛋白synaptophysin和PSD95參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，其表達(dá)量的多少提示了突觸的丟失情況[19]。GluR1是α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPAR)R1亞基，AMPAR在突觸可塑性及沖動(dòng)傳遞中發(fā)揮重要的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIG可以增加SAMP8小鼠腦內(nèi)synaptophysin、PSD95和GluR1的表達(dá)，提示CIG給藥可以改善突觸的丟失和功能。

本研究進(jìn)一步探討了CaMKIIα的表達(dá)及激活情況。CaMKIIα為神經(jīng)元突觸后致密成分中重要組分部分，是一種鈣離子激活的酶，它作為一個(gè)興奮轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的介導(dǎo)因子在學(xué)習(xí)和記憶功能方面發(fā)揮重要作用[21]。CaMKIIα在激活后，蘇氨酸(Thr)286位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，參與神經(jīng)突觸的重塑、學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)等過程[22-23]。本研究中發(fā)現(xiàn)CIG明顯增加p-CaMKIIα的表達(dá)，提示CIG可能增加了SAMP8小鼠腦內(nèi)突觸的重塑和突觸可塑性。

綜上，本研究提示CIG可能有利于治療老化引起的認(rèn)知障礙及AD樣的病理改變。