武文鵬，谷栩萌，孫興華，王春霞△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)又稱為老年性癡呆，是一種常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1-3]，以進(jìn)行性的智能衰退、精神行為異常為臨床表現(xiàn)[4-5]，以老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)為病理特征[6-8]。隨著人口老年化加劇，阿爾茨海默病的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，且已成為僅次于惡性腫瘤和心腦血管疾病的重要致死性疾病。迄今尚無有效的預(yù)防與治療阿爾茨海默病的策略[9-10]。已有研究表明，炎癥反應(yīng)參與阿爾茨海默病的發(fā)生與發(fā)展的過程，慢性持續(xù)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致阿爾茨海默病漸進(jìn)性神經(jīng)損傷[11-13]。針灸療法在阿爾茨海默病的防治中發(fā)揮著重要作用，并被廣泛應(yīng)用于臨床[14-16]。但有關(guān)針刺調(diào)控阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究較少。因此，本研究從神經(jīng)炎癥反應(yīng)通路入手，通過雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ制備大鼠AD模型，通過測定IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和COX-2、NF-κB的蛋白表達(dá)水平，探討頭穴叢刺對NF-κB信號通路的調(diào)控，了解其抗炎反應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；超速冷凍離心機(jī)(型號：H-2050R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；熒光定量PCR儀(型號：Exicycler 96，韓國BIONEER公司)；徠卡RM2135型切片機(jī)(德國Leica)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic公司)；LKB-V型超薄切片機(jī)(瑞士BROMMA公司)。

1.1.2 試劑 淀粉樣β蛋白片段1-42(批號：MB3894，大連美倫生物技術(shù)有限公司)；COX-2免疫組化試劑盒(貨號：BA3708，武漢博士德生物公司)；NF-κB免疫組化試劑盒(貨號：A00284-1，武漢博士德生物公司)；兔抗多克隆一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗多克隆二抗PV6001(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；IL-1β ELISA試劑盒(貨號：EK0393，武漢博士德生物公司)；IL-6 ELISA試劑盒(貨號：EK0412，武漢博士德生物公司)；TNF-α ELISA試劑盒(貨號：EK0526，武漢博士德生物公司)；TRIpure(貨號：RP1001，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(貨號：PR6502，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；RNase inhibitor(貨號：RP5602，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(貨號：PR1702，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；SYBR Green(貨號：SY1020，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠70只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(220±20)g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK(黑)2016004]。

1.2.2 動物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將過于遲鈍或反應(yīng)特別敏感的大鼠剔除，保留60只大鼠作為實(shí)驗(yàn)用。按隨機(jī)原則，分出12只為正常組，再分出12只為假手術(shù)組，其余大鼠用于AD模型制備。取AD造模成功大鼠24只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和頭穴叢刺組，每組各12只。

1.3 AD模型制備

采用雙側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型。采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，固定大鼠于腦立體定位儀上，以Bregma為0點(diǎn)，向后3 mm,左右旁開1.5 mm，鉆顱骨打孔，應(yīng)用微量進(jìn)樣器經(jīng)打孔處進(jìn)針，深入顱內(nèi)3 mm，將Aβ1-42溶液2.5 μg/μL緩慢注入，注射速度為0.5 μL/min，留針5 min。退針后，縫合頭皮并切口消毒。假手術(shù)組除用等量生理鹽水代替Aβ1-42溶液外，其余同模型組。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 頭穴叢刺組 造模成功后第7天開始，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[17]取穴，取百會穴及百會穴左側(cè)旁開1 mm處、百會穴右側(cè)旁開1 mm，用0.35 mm×15 mm毫針針刺，針刺深度約2 mm，每穴平補(bǔ)平瀉快速捻轉(zhuǎn)1 min，留針30 min，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.4.2 正常組 不給予任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.4.3 假手術(shù)組、模型組 同時(shí)段抓取、捆綁固定30 min，不進(jìn)行其他處理。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 免疫組化法檢測海馬組織COX-2、NF-κB的表達(dá) 最后1次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取6只大鼠，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，斷頭取腦組織，在冰臺上剝離雙側(cè)海馬組織，并稱重，將樣品放入4%多聚甲醛固定液中固定48 h。隨后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、組織包埋及切片。切片常規(guī)脫蠟到水，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行具體步驟，微波修復(fù)、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水透明和中性樹膠封片，Motic3000顯微攝影系統(tǒng)下采集圖片，并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，取各組大鼠海馬組織，使用TRIpure試劑盒提取總RNA，進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，檢測IL-1β、IL-6及TNF-α水平。反應(yīng)體積20 μL cDNA樣本。反應(yīng)體系含cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μM)各0.5 μL和SYBR GREEN mastermix10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。引物設(shè)計(jì)由生工生物工程(上海)有限公司根據(jù)Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則合成。IL-1β、IL-6及TNF-α基因序列：IL-1β基因序列上下游引物分別為：ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT和CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT，擴(kuò)增長度257 bp；IL-6基因序列上下游引物分別是：GTTGCCTTCTTGGGACTGATG和TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT，擴(kuò)增長度102 bp；TNF-α基因序列上下游引物分別是：CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA和TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC，擴(kuò)增長度175 bp?；颚?actin基因序列引物上下游引物分別是：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC和ATGGAGCCACCGATCCACA，擴(kuò)增長度171 bp。Real-time PCR儀反應(yīng)條件：94.00 ℃，5 min；94.00 ℃，10 s；60.00 ℃，20 s；72.00 ℃，30 s;共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析。根據(jù)RealTimePCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計(jì)算公式計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達(dá)比較

與正常組比較，假手術(shù)組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達(dá)比較

注：COX-2：a.正常組；b.假手術(shù)組；c.模型組；d.針刺組。NF-κB：e.正常組；f.假手術(shù)組；g.模型組；h.針刺組。圖1 各組大鼠海馬組織HE染色圖(400×)

2.2 各組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)比較

與正常組比較，假手術(shù)組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)比較

注：a、b：IL-1β基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖；c、d：IL-6基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖；e、f：TNF-α基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖。圖2 基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

3 討論

阿爾茨海默病是以細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)、細(xì)胞外的β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊和神經(jīng)元丟失為病理特征的多因素和異質(zhì)性神經(jīng)退行性疾病。阿爾茨海默病的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍未明確，有β-淀粉樣蛋白異常聚集、Tau蛋白過度磷酸化、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、代謝障礙胰島素抵抗、興奮性氨基酸毒性、突觸功能障礙及菌群-腸-腦軸失調(diào)等假說[18-21]。不同假說的發(fā)病機(jī)制之間存在相互的作用，任何單一假說均不能完全解釋阿爾茨海默病的發(fā)病全過程，為多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇。中醫(yī)學(xué)對本病的認(rèn)識較早，如《景岳全書·雜病謨》曰：“癡呆證，凡平素?zé)o痰，而或以郁結(jié)，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐，而漸至癡呆，言辭顛倒，舉動不經(jīng)……其證則千奇萬怪，無所不至?！敝嗅t(yī)藥在延緩阿爾茨海默病的進(jìn)展及提高患者體質(zhì)方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。頭穴叢刺針法是以中醫(yī)學(xué)經(jīng)絡(luò)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)解剖理論為基礎(chǔ)建立起來的以在頭部相應(yīng)治療區(qū)進(jìn)行“叢式”的針刺治療疾病的一種方法，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療。課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，頭穴叢刺能夠延緩阿爾茨海默病的進(jìn)展，改善患者的認(rèn)知功能。但有關(guān)頭穴叢刺治療阿爾茨海默病作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。因此，探究中醫(yī)藥防治阿爾茨海默病的思路與途徑具有重要的價(jià)值與意義。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)機(jī)制是近年來阿爾茨海默病研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，被認(rèn)為是阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展的重要致病因素，其中細(xì)胞因子和免疫相關(guān)基因是關(guān)鍵的參與者，在阿爾茨海默病的病理生理學(xué)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[22-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病患者的大腦中存在補(bǔ)體防御蛋白、細(xì)胞因子及急性期反應(yīng)物等炎癥指標(biāo)[26]。β-淀粉樣蛋白具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和DNA損傷的作用，β-淀粉樣蛋白能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)其釋放炎癥因子。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，其重要的生理功能是通過分泌細(xì)胞因子維持組織環(huán)境的穩(wěn)定，其釋放的細(xì)胞因子包括促炎因子(如IL-6、IL-12、IL-18、IL-1β及TNF-α等)和抗炎因子(如TGF-β、IL-10等)。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅能夠直接吞噬可溶性β-淀粉樣蛋白，還能夠通過細(xì)胞外蛋白酶對不可溶性寡聚體狀態(tài)的β-淀粉樣蛋白進(jìn)行溶解[27]。當(dāng)β-淀粉樣蛋白異常聚集時(shí)，能夠使炎癥因子持續(xù)分泌，最終發(fā)展成慢性炎癥反應(yīng)，使神經(jīng)元變性損傷加重，同時(shí)持續(xù)分泌的炎癥因子能夠下調(diào)細(xì)胞表面的β-淀粉樣蛋白吞噬受體表達(dá)，進(jìn)而影響小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能。迄今為止，已有包括IL-1β、IL-6及TNF-α在內(nèi)的13種細(xì)胞因子與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[28]。IL-1β在體液和細(xì)胞免疫中起始動作用，能夠誘發(fā)炎性反應(yīng)，IL-1β過度表達(dá)能夠使小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6等炎性因子上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白的前體蛋白過度生成。此外，在動物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1β過表達(dá)的阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠可使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥反應(yīng)加重；IL-1β能夠誘導(dǎo)阿爾茨海默病動物模型大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生Tau蛋白磷酸化等特征性病理改變[29]。TNF-α是免疫和炎癥過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，主要由免疫細(xì)胞釋放，在機(jī)體的各個部位發(fā)揮著重要作用。在阿爾茨海默病患者尸檢的腦組織β-淀粉樣蛋白斑塊周圍發(fā)現(xiàn)TNF-α的存在，這是其參與阿爾茨海默病之間聯(lián)系的直接證據(jù)[30]。IL-6作為免疫炎性調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞存活、能量代謝平衡及神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用。在阿爾茨海默病模型小鼠中發(fā)現(xiàn)IL-6過表達(dá)，并增加小膠質(zhì)細(xì)胞對β-淀粉樣蛋白的吞噬作用，同時(shí)增加TNF-α及其他炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示模型組大鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)增強(qiáng)；與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6及TNF-α基因mRNA表達(dá)水平均明顯降低，提示頭穴叢刺能夠抑制大鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是大腦的多種神經(jīng)元基因靶點(diǎn)，參與機(jī)體的神經(jīng)傳遞、細(xì)胞生長、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及其應(yīng)激反應(yīng)等。β-淀粉樣蛋白肽是老年斑的主要成分，其能夠刺激NF-κB活性，而NF-κB抑制劑能夠減少β-位點(diǎn)APP裂解酶1的生成及減少β-淀粉樣蛋白前體的產(chǎn)生。有研究表明，NF-κB信號通路的激活在β-淀粉樣蛋白前體被分泌酶活性蛋白水解而產(chǎn)生致病性β-淀粉樣蛋白過程中起著重要作用[32-33]。致病性β-淀粉樣蛋白聚集體能夠使神經(jīng)元細(xì)胞的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放。COX-2是NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶基因之一，與阿爾茨海默病的炎性反應(yīng)過程密切相關(guān)[34]?；罨腘F-κB與其在COX-2啟動區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，能夠促進(jìn)COX-2表達(dá)，活化的COX-2通過炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致腦損傷，進(jìn)而參與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展[35]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達(dá)量顯著升高，提示模型組大鼠COX-2、NF-κB活化增強(qiáng)；與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬組織COX-2、NF-κB表達(dá)量明顯降低，提示頭穴叢刺能夠抑制COX-2、NF-κB活化。

綜上所述，運(yùn)用頭穴叢刺針刺法能夠抑制NF-κB通路蛋白表達(dá)而調(diào)控炎性細(xì)胞因子而減少阿爾茨海默病模型大鼠的炎性反應(yīng)。