戴曉紅，于學(xué)平，匡炳霖，滕 偉，于薇薇，馬慧慧，陳秋欣，鄒 偉△

(1.黑龍江神志醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)后繼發(fā)的腦組織損傷是影響預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[1]，而炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列級聯(lián)反應(yīng)對腦出血后繼發(fā)性腦損傷起決定性作用?；钚匝?Reactiveoxygen species，ROS)引起的氧化應(yīng)激損傷成為繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一[2-3]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制起關(guān)鍵作用[4-5]。研究認為，腦出血后，為了抑制氧化應(yīng)激損傷，體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)激活，從而發(fā)揮保護腦細胞的作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子2/抗氧化元件(Nrf2/ARE)信號通路是體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化通路[6-7]。腦出血后血腫周圍迅速發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，Nrf2通過磷酸化與胞漿蛋白(Kelch-like ECH-associated protein-1， Keap1)發(fā)生解離，進入細胞核，與抗氧化元件(Antioxidant respon-sive element， ARE)序列結(jié)合，從而調(diào)控其下游的靶蛋白血紅素加氧酶1(NF-erythroid 2-related factor 2，HO-1)、醌氧化還原酶1(Heme oxygenase 1，NQO1)等抗氧化酶和解毒酶的表達，保護腦細胞免受氧自由基等活性物質(zhì)的侵害[8-10]。

針灸在中風(fēng)后的治療中顯示出較好的療效，大量研究顯示，針刺具有拮抗腦水腫、修復(fù)和重塑受損神經(jīng)、減輕炎性反應(yīng)和防治腦損傷等作用，針刺可以通過多靶點干預(yù)，明顯降低腦出血大鼠神經(jīng)缺損的程度，明顯恢復(fù)大鼠的神經(jīng)功能[11]。本實驗觀察“百會”透“曲鬢”頭針療法對Nrf2/ARE信號通路上轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子2(Quinone oxidoreductase1，Nrf2)、HO-1和NQO1表達的影響，探討該療法拮抗腦出血后腦組織氧化應(yīng)激損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體質(zhì)量280～320 g，實驗動物購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[動物質(zhì)量合格證書號：SCXK(黑)2016-015]。大鼠均分籠飼養(yǎng)，在安靜環(huán)境下，給予正常溫控、光照，室溫20～23 ℃，濕度50%～60%，自由飲水。造模前禁食12 h，禁水6 h。所有程序均按照國家衛(wèi)生研究所實驗動物護理和使用指南執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 儀器 立體定位儀(STW-1型，中國成都儀器廠)；臺式牙鉆機(307-6型，中國上海齒科醫(yī)械廠)；電熱恒溫干燥箱(德國梅爾特公司)；組織勻漿器( 瑞士Fluka公司)；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-RAD公司)。

1.2.2 試劑 BCA定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司);小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(sc-130301,Santa cruz公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司);兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體(sc-722,Santa cruz公司);兔抗大鼠HO-1多克隆抗(2322-1,Epitomics公司);兔抗大鼠NQO1多克隆抗體(sc-2591,Santa cruz公司)。

1.3 動物分組、造模方法

54只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字表分為針刺組、模型組和假手術(shù)組，再將各組按照1 d、3 d和7 d不同時間分為3個亞組，每個亞組6只大鼠。參照大鼠腦立體定位圖譜[12]，根據(jù)Rosenberg[13]方法制作。給大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進行麻醉。大鼠采取俯臥位，在立體定位儀上被固定。頭部備皮消毒，沿頭顱正中縱行切開約1 cm長度切口，充分暴露前囟及冠狀縫，用牙科鉆于右側(cè)尾狀核的體表定位點(前囟點)右旁開3.5 mm、后0.2 mm處，鉆一個直徑為1.0 mm的圓孔，深達硬腦膜表面。鼠尾消毒后，距離鼠尾末梢3 cm處將其剪斷，用微量注射器取血50 μL。將微量注射器固定在立體定位儀上，將微量注射器的針頭沿鉆孔進針約6 mm，以25 μL/min速度將大鼠血液50 μL緩慢推進尾殼核，留針觀察約5 min，然后緩慢出針。牙科水泥封閉，縫合，消毒。常規(guī)脫水、浸蠟和包埋。

1.4 模型篩選

依據(jù)Berderson[14]評分法對造模后大鼠進行評分，評分>1分者即為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征。再經(jīng)取腦證實顱內(nèi)存在明確血腫，則被作為腦出血成功模型。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 針刺組 大鼠于腦出血造模成功12 h后，對其進行針刺干預(yù)。針刺部位參照《實驗動物穴位圖譜》，取大鼠患側(cè)百會穴(頂骨正中)、曲鬢穴(右眶外緣與右外耳口連線的后2/3)。針刺方法：采取由百會穴向曲鬢穴透刺的方法，選用0.30 mm×25 mm毫針針刺，進針20 mm，留針30 min，留針期間以3～4 r/s的速度進行3次捻針，每次5 min。每天針刺1次，按1 d、3 d和7 d時間點進行分組治療。

1.5.2 模型組 動物不接受任何干預(yù)，僅按要求制作腦出血模型。造模成功后，每天對大鼠進行1次與針刺組相同的捆綁，每次30 min。

1.5.3 假手術(shù)組 動物要經(jīng)過麻醉、固定、定位及取血等步驟，但不進行注血，不做任何干預(yù)。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠行為學(xué)檢測 采用Longa評分法[15]對術(shù)后1 d、3 d和7 d大鼠進行評分，以確定其神經(jīng)缺損程度，其評分越高表示運動障礙越重。具體方法如下：0分：沒有任何神經(jīng)功能缺損；1分：病灶對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：爬行時無法走直線，向病灶對側(cè)劃圈；3分：行走時向病灶對側(cè)傾倒；4分：無法自發(fā)行走，存在意識障礙。

1.6.2 腦組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達

1.6.2.1 標本采集 各組大鼠在相應(yīng)時間點干預(yù)后進行取材。使用4%水合氯醛過量麻醉大鼠，開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈根部，在右心耳處剪一小口，迅速將生理鹽水300 mL經(jīng)左心室插管灌注沖洗血液，再灌注4%多聚甲醛(PH7.2～7.4)300 mL，待大鼠肝臟及肢體變硬后斷頭取腦。剝離大鼠腦組織，距頭部血液注射點前后各2 mm冠狀切下厚度4 mm的腦片，保存在含有1‰DECP的4%多聚甲醛固定液中。

1.6.2.2 檢測Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達 采用Western blot法檢測各組大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達，取血腫灶周區(qū)域4 g組織，加入PIRA 裂解液用勻漿機研磨粉碎，離心制成上清液。經(jīng)過BCA測好蛋白濃度后，取出適量的上清液制備成樣品儲存液。取適量的樣品儲存液加入電泳槽內(nèi)進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入一抗：Nrf2抗體(1∶1 000)、HO-1抗體(1∶1 000)、NQO-1抗體(1∶1 000)、及β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。清洗后的膜用二抗(1∶15 000)孵育1 h，洗滌后緩慢搖動洗滌10 min×3次。最后進行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值，目的蛋白與β-actin灰度值得比值即為需要測定的蛋白量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

表1示，假手術(shù)組大鼠各個時間點未見任何神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組術(shù)后1 d即出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損；術(shù)后3 d，神經(jīng)功能缺損最重；術(shù)后7 d，神經(jīng)功能缺損較高峰時減輕，癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。模型組與假手術(shù)組對照，各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。針刺組大鼠各個時間點神經(jīng)功能缺損評分都明顯降低，癥狀均有明顯改善，與同期模型組對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征Longa評分比較

2.2 各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達比較

表2～4和圖1示：假手術(shù)組各時間點Nrf2、HO-1和NQO1蛋白呈少量表達，各時間點各蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。 模型組在術(shù)后1 d即檢測出Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達升高，術(shù)后3 d達高峰，至術(shù)后7 d峰值有所回落，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。針刺組各時間點Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達較模型組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠不同時相點Nrf2 Western blot結(jié)果比較

表3 各組大鼠不同時相點HO-1 Western blot結(jié)果比較

表4 各組大鼠不同時相點NQO1 Western blot結(jié)果比較

圖1 各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1及NQO1蛋白條帶

2.3 各組大鼠腦組織中Nrf2與HO-1、Nrf2與NQO1相關(guān)性分析

圖2～3示,Nrf2與HO-1回歸方程式：Y=0.104+0.819X，R2=0.862，二者呈正相關(guān)。Nrf2與NQO1回歸方程式：Y=0.136+0.696X，R2=0.883，二者呈正相關(guān)。

圖2 各組大鼠腦組織Nrf2與HO-1相關(guān)性分析

圖3 各組大鼠腦組織Nrf2與NQO1相關(guān)性分析

3 討論

腦出血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”的范疇，中醫(yī)學(xué)認為本病病機多是肝腎虧損、陰陽失調(diào)和氣血上逆兼有風(fēng)火痰瘀，瘀滯經(jīng)絡(luò)所致，屬于本虛標實之證。以往研究結(jié)果顯示針灸治療中風(fēng)類疾病具有很好的效果，其中頭針療法治療中風(fēng)病的療效尤為突出。早在《針灸大成·玉龍歌》中就有“中風(fēng)不語最難醫(yī)，發(fā)際頂門穴要知，更向百會明補瀉，實時蘇醒免災(zāi)?！钡挠涊d。《普濟方》指出：“凡忽中風(fēng)，言語謇澀，半身不遂……穴百會，耳前發(fā)際曲鬢穴”。本實驗是在導(dǎo)師鄒偉教授多年臨床經(jīng)驗與實驗研究的基礎(chǔ)上，采用“百會”透“曲鬢”頭針療法，進一步研究該頭針療法對大鼠腦出血急性期氧化應(yīng)激損傷的拮抗作用。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，機體對氧化物的清除能力下降，導(dǎo)致細胞凋亡和組織損傷[16-17]。氧化應(yīng)激已被確定為ICH繼發(fā)性損傷的重要發(fā)病機制，不僅涉及ICH的病理過程，還參與了ICH病理生理反應(yīng)的多個重要階段[18]。國內(nèi)外的研究證實，Nrf2/ARE信號通路作為機體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[19]，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]，是抵御外源性刺激和毒物的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[21]。大量實驗研究證實[22]，建立Nrf2基因敲除小鼠腦出血模型，與Nrf2基因未敲除小鼠腦出血模型對照，結(jié)果顯示：前者血腫周圍白細胞浸潤增多、血腫體積增大，DNA損傷加重及ROS產(chǎn)生增多[23-24]。Yan等[25]制作大鼠右側(cè)頂葉腦皮層挫裂傷模型，RT-PCR結(jié)果顯示，外傷組HO-1和NQO1 mRNA水平上調(diào)；Western blot結(jié)果顯示，外傷組細胞核內(nèi)Nrf2蛋白水平較對照組顯著升高；免疫組化結(jié)果顯示，外傷組較對照組Nrf2和HO-1表達增多。提示Nrf2-ARE通路在腦外傷中具有保護作用。Li等[26]制作急性ICH大鼠模型，結(jié)果顯示：NQO1、HO-1、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的表達隨著Nrf2表達增多而增多，說明Nrf2可上調(diào)上述抗氧化酶的表達。因此，Nrf2-ARE通路具有保護神經(jīng)損傷的作用。

本實驗采用Longa評分法，綜合評價大鼠神經(jīng)功能缺損程度。針刺組大鼠在1 d、3 d和7 d的神經(jīng)功能缺損評分都較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著針刺效應(yīng)的逐漸積累，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀均有明顯改善。由此可見，對腦出血急性期大鼠給予“百會”透“曲鬢”針刺療法，能明顯改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，促進大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。觀察各組大鼠不同時間點腦組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠可見少量Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達。術(shù)后1 d，模型組大鼠即有相當(dāng)數(shù)量表達，術(shù)后3 d達到最高值，術(shù)后7 d降低。說明腦出血后即存在Nrf2-ARE信號通路的激活，也說明腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理過程中存在Nrf2及其下游靶蛋白HO-1、NQO1的參與。針刺組大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白在1 d、3 d和7 d表達的趨勢與模型組相同，其每個時間點均高于模型組。這表明針刺能夠促進腦出血大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達，從而起到保護腦細胞、減少腦組織繼發(fā)性損傷的作用。

本實驗通過對Nrf2、HO-1和NQO1之間進行了相關(guān)性分析，得出Nrf2與HO-1的表達呈正相關(guān)，Nrf2與NQO1的表達呈正相關(guān)，而針刺“百會”透“曲鬢”可以促進Nrf2、HO-1和NQO1的表達，它們之間相互協(xié)同參與對抗腦出血氧化應(yīng)激損傷。由此說明這種神經(jīng)保護作用機制發(fā)揮可能與Nrf2-ARE信號通路激活后，調(diào)控其下游的靶蛋白HO-1、NQO1的表達有關(guān)。

從上世紀90年代末開始，導(dǎo)師鄒偉教授一直在研究針刺“百會”透“曲鬢”穴治療腦出血。鄒偉教授科研團隊從組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎性反應(yīng)、細胞凋亡和神經(jīng)重塑機制等[27-29]方面進行了大量的實驗研究，進一步證實了“百會”透“曲鬢”針刺法對腦出血后腦組織損傷有保護和修復(fù)作用。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步探討了“百會”透“曲鬢”針刺法對Nrf2-ARE信號通路的作用機制,證實該針刺法可以明顯降低腦出血大鼠腦組織缺損評分，改善大鼠神經(jīng)缺損癥狀,也闡明了該針刺法可以激活機體內(nèi)源性抗氧化通路，從而拮抗氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮腦保護作用，為腦出血的臨床治療及針刺機理的進一步研究提供了新的思路。

由于技術(shù)條件的限制，本研究未在Nrf2、HO-1及NQO1基因敲除大鼠模型中驗證“百會”透“曲鬢”頭針療法對腦出血的神經(jīng)保護作用，為本研究的不足之處。