陳 方，李 恒，游 慧，邱煜焱，王 寧，陳 微

0引言

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是一種致盲性疾病，是導致孔源性視網(wǎng)膜脫離手術修復失敗的主要原因。一旦形成，PVR就很難治療。因此，開發(fā)預防PVR的方法非常重要。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因是一種人體內(nèi)自然生成的細胞因子，目前已有研究表明抗VEGF治療可以減輕玻璃體的生物活性預防臨床PVR的形成[1]。

目前越來越多的研究表明人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與增殖膜的形成在PVR的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[2-3]。miRNA是新發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達來影響機體功能的一類小分子非編碼RNA，已有證據(jù)表明，許多miRNA分子通過RPE增殖、遷移以及凋亡參與PVR的形成，如miRNA-146a和miR-194等[4-5]。miRNA-147是研究報道較多的一種小RNA，在類風濕性關節(jié)炎、惡性腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[6-7]。但miRNA-147與PVR相關性尚未見報道。本研究前期生物信息學篩查發(fā)現(xiàn)，VEGF可能是miRNA-147的靶基因。miRNA-147與VEGF在PVR發(fā)生發(fā)展過程中是否具有調(diào)控作用，有待于進一步探究。因此，以ARPE-19細胞為研究對象，初步探討了miRNA-147靶向調(diào)控VEGF對ARPE-19細胞的生物學行為的影響。

1材料和方法

1.1材料主要試劑：ARPE-19細胞系購于上海佰曄生物科技中心。DAB顯色試劑盒、MTT試劑盒、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol購自北京索萊寶科技有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。野生型和突變型的VEGF 3’-UTR雙熒光報告質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。DMEM、胎牛血清購于美國Gibco公司。miRNA-147模擬物(ATCGTCTTCGTAAAGGCGTGTG)及其對照(AGTTCTTGCACGGAACGTACG)、VEGF抑制劑(GTCATGAAGTTCATGGATG)以及對照(GTGTGGATGAAAGTATGTC)、VEGF過表達(上游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’；下游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’)及空載體(上游：5’-TTTATCTCCGTCGGCCTTCT-3’；下游：5’-TTTCCTTTCTCCCCATCTTTG-3’)均由Biomics公司設計合成。兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體及HRP標記羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及分組將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期ARPE-19細胞按照每孔2×105個接種至6孔細胞板上，置于37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書步驟進行轉(zhuǎn)染，取miRNA-147模擬物及其對照、VEGF抑制劑以及對照組、VEGF過表達及空載體，分別用無血清培養(yǎng)液稀釋至100nmol/L，每孔2mL含有脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實驗分為空白對照組(不處理)、無義miRNA組(轉(zhuǎn)染mimic NC)、miRNA-147模擬物組(轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物)、抑制劑陰性對照組(轉(zhuǎn)染shRNA NC)、VEGF抑制劑組(轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑)、miRNA-147模擬物+空載病毒載體組(miRNA-147模擬物和空載體)和miRNA-147模擬物+VEGF過表達組(轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物和VEGF過表達)。

1.2.2RT-qPCR實驗檢測各組miRNA-147和VEGFmRNA的表達收集各組轉(zhuǎn)染48h后的ARPE-19細胞，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測miRNA-147和VEGF mRNA的表達，以U6和GAPDH為內(nèi)參。miRNA-147正向：5’-GGGGTGTGTGGAAAT-3’，反向：5’-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。VEGF正向5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’，反向：5’-CCTGGTGAGATCTGGTTC-3’；GAPDH正向：5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’，反向：5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。RT-qPCR反應程序和反應體系參照說明書。采用2-△△Ct的方法進行相對定量分析。

1.2.3熒光素酶報告基因檢測miRNA-147和VEGF靶向關系將對數(shù)生長期的ARPE-19細胞以每孔105個接種至12孔細胞板上，將WT-3’UTR、MUT-3’UTR與miRNA-147模擬物或無義miRNA共轉(zhuǎn)染至ARPE-19細胞。每組實驗設置3個重復。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.4Westernblot實驗檢測各組VEGF蛋白的表達收集各組轉(zhuǎn)染48h后的ARPE-19細胞，分別加入RIPA裂解液并在冰上放置20min，4℃ 13 000r/min離心20min，采用BCA試劑盒測定上清的蛋白含量。取35μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗(1∶1 000)4℃過夜，以β-actin抗體(1∶10 000)為參照，再加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

1.2.5MTT實驗各組細胞培養(yǎng)48h后，每孔加入終濃度為0.5mg/mL MTT。孵育4h后每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，放置酶標儀上波長為570nm下測定吸光度OD值。

1.2.6流式細胞術檢測實驗各組細胞培養(yǎng)48h后，棄細胞培養(yǎng)液。各組取10萬個的細胞加入195μL結合液和Annexin V-FITC 5μL，避光孵育10min，1 000r/min離心5min棄上清，再加入190μL結合液和10μL碘化丙啶染色液，低溫避光放置10min后進行流式細胞儀檢測。

1.2.7細胞劃痕實驗取各組細胞加入孔板中，每孔背后含有5條橫線并含有5×105個細胞。過夜培養(yǎng)后，用200μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細胞。處理24h后，取樣拍照。

2結果

2.1各組ARPE-19細胞miRNA-147表達水平比較空白對照組、無義miRNA組和miRNA-147模擬物組miRNA-147表達水平分別為：1.00±0.14、1.02±0.12、5.39±0.49，各組細胞miRNA-147表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=213.102，P<0.05)。與空白對照組和無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組miRNA-147表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t=17.919、17.838，均P<0.05)，提示ARPE-19細胞miRNA-147轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

圖1 各組ARPE-19細胞miRNA-147表達水平比較 aP<0.05 vs 空白對照組；cP<0.05 vs 無義miRNA組。

2.2各組ARPE-19細胞VEGFmRNA表達水平比較各組細胞VEGF mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=82.445，P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.980，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組VEGF mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.582，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組VEGF mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.086，P<0.05)，見表1。

表1 各組ARPE-19細胞各項指標比較

2.3各組ARPE-19細胞VEGF蛋白表達水平比較各組細胞VEGF蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=163.719，P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.073，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組VEGF蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.577，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組VEGF蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=20.100，P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 各組ARPE-19細胞VEGF蛋白表達水平比較。

2.4雙熒光素酶實驗驗證miRNA-147與VEGF靶向關系雙熒光素酶報告實驗結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-147和VEGF能夠靶向結合。miRNA-147模擬物能夠顯著抑制VEGF-WT報告載體的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.256，P<0.05)；而miRNA-147模擬物對VEGF-MUT報告載體的熒光素酶活性沒有明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.736，P>0.05)，見圖3。

圖3 miRNA-147靶向調(diào)控VEGF的表達 aP<0.05 vs無義miRNA組。

2.5過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞增殖水平的影響48h后各組細胞增殖水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=23.267，P<0.05)。miRNA-147模擬物組細胞增殖水平與無義miRNA組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.920，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組增殖水平水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.728，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組增殖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.608，P<0.05)，見表1。

2.6過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞凋亡水平及細胞周期的改變流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn)，各組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數(shù)、S期和G2期細胞數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=128.468，F(xiàn)=140.761，F(xiàn)=24.485，F(xiàn)=25.736，均P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數(shù)顯著增加；而S期、G2期細胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(t=12.446、9.956、3.908、4.007，均P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組細胞凋亡率及G0/G1期細胞數(shù)為明顯增加，而S期、G2期細胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(t=13.279、15.089、9.298、4.810，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數(shù)減少，而S期、G2期細胞數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(t=18.174、19.731、4.815、9.455，均P<0.05)，見表2，圖4、5。

圖4 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞凋亡水平的影響。

圖5 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞周期的影響。

表2 各組ARPE-19細胞凋亡率和細胞周期比例比較

2.7過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞遷移能力的影響各組細胞相對劃痕寬度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=188.141，P<0.05)。轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物或轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑后細胞相對劃痕寬度與各自陰性對照組比較均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(t=13.388、12.732，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組細胞相對劃痕寬度顯著減小，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.961，P<0.05)，見表1、圖6。

圖6 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞遷移能力的影響。

3討論

RPE細胞位于神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受器的最外層，其功能異常、退化或死亡等通常會引起包括PVR在內(nèi)的多種嚴重視網(wǎng)膜疾病。值得一提的是，RPE細胞的增殖和遷移是PVR的形成的主要原因。目前研究表明在人類視網(wǎng)膜、角膜、晶狀體等眼部組織中已發(fā)現(xiàn)上百種miRNA表達，miRNA通過調(diào)控下游靶基因，維持眼部組織的正常功能[8]。近年來，miRNA與RPE細胞的關聯(lián)成為眼科的研究熱點。如Zhao等[9]研究表明miR-145可以抑制RPE細胞的增殖，誘導其凋亡率。Wang等[10]研究表明miR-182通過靶向間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-Met)抑制肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)誘導的RPE細胞增殖和遷移增加，改善PVR及其引起的并發(fā)癥。Jun等[11]研究表明miR-124可能通過Ras同源家族成員G(RHOG)抑制RPE細胞增殖和遷移，減輕視網(wǎng)膜疾病中纖維血管增生。這提示miRNA可通過抑制RPE細胞的增殖和遷移作為預防PVR疾病發(fā)生的靶點。

如今關于miRNA-147的研究大多是關于各類腫瘤細胞，經(jīng)證實，miRNA-147過表達抑制乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞增殖發(fā)揮抑癌作用，而促進食道癌細胞增殖發(fā)揮致癌作用[7,12-14]。由此可知，miRNA-147在不同的癌組織中發(fā)揮著完全不同的作用。除此之外，Sui等[15]研究表明MicroRNA-147通過抑制同源盒蛋白C6(HOXC6)抑制人肝細胞癌增殖遷移。由此推測miRNA-147有可能參與RPE細胞增殖和遷移。本研究通過脂質(zhì)體法向RPE細胞中轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物，結果表明轉(zhuǎn)染miRNA-147模擬物后RPE細胞凋亡水平顯著增加、而細胞增殖和遷移能力降低。這與推測結論一致，提示miRNA-147在RPE細胞增殖、凋亡和遷移過程中發(fā)揮著重要作用，miRNA-147可通過抑制RPE細胞的增殖和遷移作為抑制PVR疾病發(fā)展的靶點之一，但其具體的調(diào)控機制有待于進一步探究。

VEGF是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種與血管增殖有關的生長因子，基因位于6號染色體的P12～P21區(qū)域，8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄時可剪接成VEGF121、VEGF165、VEGF145、VEGF206、VEGF189 5種異構體[16]。VEGF在含有血管結構如結膜、虹膜、脈絡膜及視網(wǎng)膜的正常眼組織中表達較低，VEGF與VEGF受體(VEGFRs)結合參與視網(wǎng)膜血管形成，并維持血管內(nèi)皮細胞活性[17]。VEGF水平升高是許多眼部血管疾病已知的主要原因之一，同時，抗VEGF療法已被常規(guī)應用于治療眼血管疾病。Pennock等[1]研究表明VEGF主要通過間接激活血小板來源的生長因子受體的活性，促進玻璃體視網(wǎng)膜病變的增殖，且在兔玻璃體內(nèi)注射VEGF抑制劑可以預防PVR發(fā)生。本研究結果表明，轉(zhuǎn)染VEGF抑制劑可抑制RPE細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡。這與雷祥等[18]研究結果一致，其研究結果表明丹參酮ⅡA在缺氧條件下通過抑制VEGF的表達抑制RPE細胞增殖，將細胞阻滯在G0/G1期，促進細胞凋亡。

近年來越來越多的證據(jù)表明，miRNA可影響VEGF信號通路轉(zhuǎn)導過程。陳云霞等[19]研究表明，miR-27可能通過調(diào)節(jié)糖代謝、VEGF過程介導糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病及進展。本研究在Targetscan數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)，VEGF 3’-UTR中存在miRNA-147的目標堿基序列，且RT-qPCR和Western blot分析結果顯示，VEGF在miRNA-147模擬物轉(zhuǎn)染后下調(diào)，由此我們推測miRNA-147對VEGF有靶向調(diào)控作用。此外，本研究通過單獨抑制VEGF基因表達實驗顯示，下調(diào)VEGF抑制RPE細胞的增殖、遷移，促進細胞凋亡；過表達VEGF可逆轉(zhuǎn)miRNA-147模擬物對RPE細胞增殖、遷移和凋亡的抑制作用，提示miRNA-147通過靶向VEGF抑制RPE細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡，對PVR的進展發(fā)揮重要作用。這與Hu等[20]和Linetsky等[21]研究結果一致。

綜上所述，miRNA-147在RPE細胞增殖、凋亡和遷移過程中發(fā)揮著重要作用，其作用機制可能與靶向抑制VEGF表達有關，提示miRNA-147有望成為預防PVR新靶點。