周克平 宋文龍 肖林秀 吳芳芳

（1浙江省杭州市建德市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 建德 311600；2浙江省杭州市建德市第一人民醫(yī)院 建德 311600）

中醫(yī)學(xué)認為，脾居于人體中焦，為“中央之土”，主運化，為氣血生化之源，五臟六腑氣機升降出入賴之維持。人體生理機能的正常運轉(zhuǎn)，有賴于脾胃將攝入的營養(yǎng)物質(zhì)化為精微，吸收轉(zhuǎn)輸至全身，維持人體內(nèi)外平衡，抵御病邪。有研究[1~4]表明，脾虛狀態(tài)下，致傷因子造成胃黏膜損傷，當(dāng)損傷超過機體原有防御及修復(fù)功能時，胃黏膜屏障作用發(fā)生紊亂，出現(xiàn)病理性損傷。

四君子湯是益氣健脾的代表方劑，來源于宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參、白術(shù)、茯苓和甘草組成，臨床用于治療脾氣虛證引起的食欲不振、脘腹虛脹等不良癥狀[5~7]。本研究通過復(fù)制大鼠脾虛模型，觀察四君子湯對脾虛大鼠胃黏膜損傷和炎癥介質(zhì)表達的影響，并與臨床常用胃黏膜保護劑（枸櫞酸鉍鉀）進行比較，分析脾虛與胃黏膜屏障功能改變之間的相關(guān)性，以期從胃黏膜損傷變化的角度出發(fā)，探討四君子湯治療脾虛大鼠的作用機制?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量330~360 g，共50只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2017-0005；合格證號：20170005023335]。試驗前飼養(yǎng)在動物房環(huán)境中適應(yīng)1周后開始進行造模及后續(xù)試驗。

1.2 藥物及試劑 小承氣湯由厚樸、枳實、大黃（比例3:3:2）組成；四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草（比例2:2:2:1）組成，均由醫(yī)院藥劑科提供，并由制劑室煎取后[8]，70℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至220 ml，即得到濃縮液每毫升含生藥量1.0 g。滅菌注射用水（國藥準字H41024240）、枸櫞酸鉍鉀片（國藥準字H10920098，使用滅菌注射用水配置成濃度為1 800 mg/L含藥溶液）、生理鹽水（國藥準字H20013310，使用滅菌注射用水配置成濃度為1 800 mg/L含藥溶液）；Rat IL-6 ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，貨號EK306/3-48；Rat TNF-αELISA試劑盒，聯(lián)科生物，貨號EK382/3-48。

1.3 儀器 全波長酶標儀，SpectraMax Plus 384型，美國MD；離心機，L3-800R低速冷凍離心機，采購自湖南湘儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠分組及模型建立50只大鼠常規(guī)飼喂l周后隨機分為空白對照組、脾虛模型組、自然康復(fù)組、四君子湯組和西藥組（枸櫞酸鉍鉀），各10只。除空白對照組外，其余4組均制作大鼠長期脾虛模型。脾虛模型組大鼠小承氣湯3 ml/（次·只）灌胃，隔日1次，同時隔日喂食，共24周[9~10]。

1.4.2 給藥 空白組大鼠常規(guī)飼喂，并采用生理鹽水3 ml/次，隔日1次進行灌胃，持續(xù)24周；脾虛模型組大鼠每2天喂食1次，模擬饑飽失節(jié)，聯(lián)合小承氣湯3 ml/次灌胃，隔日1次，共24周；自然康復(fù)組大鼠前20周飼喂與脾虛模型組一致，20周后予常規(guī)飼養(yǎng)，共24周；四君子湯組飼喂前20周同脾虛模型組，20周后改常規(guī)飼喂，并予四君子湯（4 ml/次）連續(xù)灌胃4周，1次/d；西藥組飼喂前20周同脾虛模型組，20周后改常規(guī)飼喂，按13.5 mg/kg（3 ml）給予枸櫞酸鉍鉀灌胃，連續(xù)灌胃4周，1次/d。均于實驗24周末處死大鼠進行取材處理。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 脾虛大鼠成模評價 通過對各組大鼠造模前后的行為變化、體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)、大便性質(zhì)進行對比和分析。

1.5.2 ELISA檢測 （1）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平檢測：使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫。制備標準品，依次倍比稀釋成300.00 pg/ml、150.00 pg/ml、75.00 pg/ml、37.50 pg/ml、18.75 pg/ml、9.38 pg/ml、4.69 pg/ml，標準品稀釋液（0 pg/ml）直接作為空白孔。加樣，預(yù)設(shè)7個標準孔，按濃度梯度分別加入100μl標準品。空白孔則僅加入100μl試劑稀釋液，其余各孔則分別加入樣品10μl及檢測緩沖液90μl。檢測抗體，每孔加入50μl經(jīng)稀釋抗體。封板后以300 r/min下震蕩，室溫孵育2 h。棄孔內(nèi)液體，以350μl的洗滌液重復(fù)洗6次后吸水紙上拍干。每孔加入100μl稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素后封板，300 r/min下震蕩孵育45 min。棄孔內(nèi)液體，以350μl的洗滌液重復(fù)洗6次后吸水紙上拍干。上述步驟完成后每孔加TMB底物溶液100μl，避光顯色5~30 min，最后在每孔加終止溶液100μl，終止反應(yīng)。在酶標板底無水滴、無氣泡后，用酶標儀在450 nm波長和630 nm波長測量各孔的光密度值（OD值）。（2）白細胞介素-6（IL-6）水平檢測：使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫。制備標準品，依次倍比稀釋成2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml，標準品稀釋液（0 pg/ml）直接作為空白孔。其余步驟同TNF-α檢測。

1.5.3 采用Guth法評價大鼠胃黏膜的潰瘍指數(shù)摘下全胃，10 min后沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，再平展于濾紙上，全胃各病灶長度之和為損傷指數(shù)，以mm表示。損傷≤1 mm（包括糜爛點）為1分；1 mm＜損傷≤2 mm為2分；2 mm＜損傷≤3 mm為3分；3 mm＜損傷≤4 mm為4分；＞4 mm為5分；損傷寬度＞2 mm者胃黏膜潰瘍指數(shù)（UI）加倍。

1.5.4 病理改變觀察 取大鼠胃經(jīng)石蠟包埋后組織切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀察病理改變情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行分析。各樣本均數(shù)間以單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較，采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組一般情況及體質(zhì)量比較 （1）一般情況：空白對照組毛色、精神狀態(tài)及活動情況均良好；造模后（20周）造模四組均出現(xiàn)毛較凌亂，精神狀態(tài)及活動情況較萎靡，大便時有稀溏等情況；24周后，脾虛模型組毛較凌亂、精神狀態(tài)及活動情況較萎靡，自然康復(fù)組毛一般、精神狀態(tài)及活動情況尚可，西藥組及四君子湯組毛一般、精神狀態(tài)及活動情況尚可，大便性質(zhì)尚正常。（2）體質(zhì)量變化：造模前，各組大鼠間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。造模后，各組大鼠體質(zhì)量較前均有所升高，其中空白對照組[（421.60±56.89）g]及自然康復(fù)組[（402.00±25.80）g]較前升高較明顯，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與造模前比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24周后，空白對照組[（523.40±61.65）g]、四君子湯組[（508.20±27.33）g]及西藥組[（486.40±45.32）g]與脾虛模型組[（418.6±44.62）g]比較，體質(zhì)量有明顯上升，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而自然康復(fù)組體質(zhì)量（459.40±17.63）g雖較脾虛模型組有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。四君子湯組與西藥組大鼠24周時體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 五組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 五組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與空白對照組相比，#P＜0.05；與脾虛模型組相比，*P＜0.05；與自然康復(fù)組相比，△P＜0.05。

組別 n 造模前 造模后（20周） 治療后（24周）空白對照組脾虛模型組自然康復(fù)組四君子湯組西藥組10 10 10 10 10 392.80±35.75 383.00±20.45 385.40±29.45 384.60±24.13 386.00±17.44 421.60±56.89 394.40±25.01 402.00±25.80 393.60±11.06 409.00±20.63 523.40±61.65 418.60±44.62#459.40±17.63 508.20±27.33*△486.40±45.32*

2.2 五組TNF-α、IL-6水平比較 與空白對照組比較，脾虛模型組TNF-α、IL-6在血清中表達上調(diào)，且有極顯著性差異（P＜0.01）；與脾虛模型組相比，自然康復(fù)組TNF-α、IL-6含量無明顯變化（P＞0.05），提示應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠胃黏膜內(nèi)攻擊因素明顯增強，胃黏膜損傷嚴重，可能是造成胃黏膜損傷的主要因素。與脾虛模型組相比，四君子湯組及西藥組大鼠TNF-α、IL-6表達水平明顯下調(diào)，且有極顯著性差異（P＜0.01）。而相較于西藥組，四君子湯組大鼠TNF-α、IL-6表達水平與之相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合胃黏膜損傷情況，說明四君子湯對胃黏膜有與枸櫞酸鉍鉀相當(dāng)?shù)谋Ｗo和促修復(fù)作用。見表2。

表2 五組大鼠TNF-α、IL-6水平比較（pg/ml，±s）

表2 五組大鼠TNF-α、IL-6水平比較（pg/ml，±s）

注：與空白對照組相比，#P＜0.05；與脾虛模型組相比，*P＜0.01；與自然康復(fù)組相比，△P＜0.01。

組別 n空白對照組脾虛模型組自然康復(fù)組四君子湯組西藥組10 10 10 10 10 IL-6 TNF-α 61.40±23.90 766.35±166.62#711.39±140.51#407.18±25.94#*△381.82±33.76#*△164.70±29.50 567.11±29.77#532.00±18.69 227.43±27.09#*△214.44±18.31#*△

2.3 胃黏膜損傷指數(shù)觀察 空白對照組大鼠胃黏膜組織表面色澤紅潤，黏膜較為完整，無明顯潰瘍等損傷，腺體排列整齊、均勻、致密。見圖1。脾虛模型組大鼠黏膜下充血明顯，且黏膜表面呈現(xiàn)多條條索狀出血面。見圖2。自然康復(fù)組大鼠胃黏膜可見點狀及條索狀潰瘍損傷，程度較模型組減輕；而四君子湯組及西藥組大鼠胃黏膜主要表現(xiàn)為充血而條索狀潰瘍損傷不明顯。見圖3~圖5。與模型組（19.20±7.40）mm相比，四君子湯組（5.20±1.92）mm及西藥組（5.00±1.58）mm損傷程度較輕，都存在極顯著性差異（P＜0.01），且要優(yōu)于自然康復(fù)組（9.40±3.58）mm，P＜0.05，但兩藥物治療組間比較，差異無顯著性。表明四君子湯能在一定程度上緩解脾虛大鼠胃黏膜的損傷性潰瘍，療效與枸櫞酸鉍鉀相近。見表3。

圖1 空白對照組

圖2 脾虛模型組

圖3 自然康復(fù)組

圖4 四君子湯組

圖5 西藥組

表3 胃黏膜損傷指數(shù)（n＝10，mm，±s）

表3 胃黏膜損傷指數(shù)（n＝10，mm，±s）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.01；與脾虛模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與自然康復(fù)組比較，△P＜0.05。

組別 空白對照組 脾虛模型組 自然康復(fù)組 四君子湯組 西藥組Mean SD Mean±SD 0.00 0.00 0.00±0.00 19.20 7.40 19.20±7.40▲9.40 3.58 9.40±3.58▲*5.20 1.92 5.20±1.92▲#△5.00 1.58 5.00±1.58▲#△

2.4 胃組織病理改變HE染色后鏡下觀察，空白對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)、層次較清楚。見圖6。脾虛模型組大鼠胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續(xù)性中斷，水腫明顯。見圖7。自然康復(fù)組大鼠胃黏膜部分中斷，黏膜、黏膜下層部分水腫，部分可見炎細胞浸潤。見圖8。四君子湯組大鼠胃黏膜、黏膜下層充血水腫輕，腺體排列整齊，有少量炎細胞浸潤。見圖9。西藥組胃黏膜及黏膜下層稍水腫，腺體排列尚整齊，部分可見炎細胞浸潤。見圖10。

圖6 空白對照組

圖7 脾虛模型組

圖8 自然康復(fù)組

圖9 四君子湯組

圖10 西藥組

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認為，脾胃為“后天之本、氣血生化之源”。脾主運化，胃主受納，脾氣健運，則化源充足，氣血津液得以灌溉四旁，陰平陽秘，機體才能生機盎然，四臟亦可安和，即如《金匱要略》所言“四季脾旺不受邪”[11~12]。倘使脾氣虛弱，失其健運，不能正常運化水谷，輸布精微，則體內(nèi)氣血生化無以為繼，臟腑形體長期失養(yǎng)，正氣虧虛于內(nèi)，使人體防御能力不斷下降，而容易產(chǎn)生各種病證，特別是容易導(dǎo)致胃內(nèi)黏膜的損害[5~7]。臨床上，大部分慢性疾病后期都會出現(xiàn)倦怠乏力、少氣懶言、腹脹納呆、面色萎黃、大便溏薄、消瘦、舌淡苔白、脈緩弱等脾虛證主要證候。本實驗?zāi)M人體常見導(dǎo)致脾虛誘因，以小承氣湯灌胃聯(lián)合飲食失節(jié)法建模，造模結(jié)束后觀察到脾虛模型組大鼠出現(xiàn)皮毛較凌亂、精神狀態(tài)及活動萎靡，大便時有稀溏等脾虛表現(xiàn)。對大鼠胃黏膜組織進行進一步觀察，可見不同程度點狀或條索狀潰瘍損傷，HE染色下，胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續(xù)性中斷，水腫明顯，提示大鼠造模成功。

正常情況下，胃黏膜對損傷有一定自我修復(fù)能力。作為常見細胞因子，TNF-α主要由脂肪組織中單核-吞噬細胞及其他多種細胞產(chǎn)生，不但能夠有選擇性地殺傷某些腫瘤細胞，對正常細胞無明顯毒性，還能在一定程度上發(fā)揮對免疫、感染與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用[13]。近年研究[14~18]表明，TNF-α作為胃黏膜炎癥發(fā)生發(fā)展階段的重要內(nèi)源性細胞因子之一，在胃黏膜炎癥反應(yīng)中起到重要作用：（1）提升機體內(nèi)中性粒細胞的活化、趨化及黏附水平，耗氧量顯著增加，產(chǎn)生大量氧自由基，上調(diào)局部炎癥反應(yīng)水平；（2）可提高白細胞在血管內(nèi)皮細胞上黏附性，使內(nèi)皮細胞受到損傷而啟動血管內(nèi)凝血系統(tǒng)，引起機體局部血液循環(huán)障礙，影響到黏膜血氧供給加劇潰瘍。此外，高水平的IL-6可以長時間作用于胃黏膜，消耗大量的上皮細胞，引起胃酸分泌減少，削弱了對胃內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的防御能力，有利于有害物質(zhì)對胃黏膜的侵蝕、損害，也是參與潰瘍形成的一個關(guān)鍵性細胞免疫因素[17~21]。曹琰、徐小穎等[22~23]發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，脾虛大鼠血清中TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6等細胞因子表達顯著上調(diào)，而健脾類中藥能通過改善脾虛大鼠的消化道系統(tǒng)，調(diào)節(jié)上述細胞因子的分泌，提升機體的免疫功能，發(fā)揮健脾益氣功效。在本實驗中，與空白對照組大鼠相比，脾虛模型組大鼠TNF-α、IL-6水平也表現(xiàn)出上升趨勢，與上述研究結(jié)果相似，結(jié)合脾虛模型組大鼠胃黏膜表現(xiàn)，表明IL-6、TNF-α升高可使大鼠胃黏膜出現(xiàn)實質(zhì)性損傷。

作為臨床常用補氣健脾經(jīng)典方藥，四君子湯源出《太平惠民和劑局方》，常用于“榮衛(wèi)氣虛，臟腑怯弱。心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，穢吐逆……”。人參、白術(shù)、茯苓和甘草為其組成藥物。本研究通過直接觀察，測量并計算大鼠胃黏膜潰瘍損傷指數(shù)，同時對大鼠胃黏膜病理變化進行對比，發(fā)現(xiàn)脾虛大鼠胃黏膜組織可見不同程度點狀或條索狀潰瘍損傷，HE染色下，胃黏膜變薄，黏膜上皮細胞壞死，呈片狀脫落，連續(xù)性中斷，水腫明顯。經(jīng)四君子湯干預(yù)后，大鼠胃黏膜及黏膜下層出血、充血、糜爛均輕于脾虛模型組，腺體排列整齊，炎細胞浸潤情況減輕，與西藥組接近；血清檢測結(jié)果顯示，脾虛證能明顯上調(diào)TNF-α、IL-6的表達水平，從而降低脾虛大鼠胃黏膜局部損傷修復(fù)功能，經(jīng)四君子湯原方治療后脾虛大鼠的TNF-α、IL-6明顯下降，胃黏膜損傷指數(shù)改善，說明四君子湯能通過下調(diào)TNF-α、IL-6表達，促進脾虛大鼠黏膜屏障的修復(fù)。

綜上所述，研究結(jié)果部分驗證了四君子湯對于防治脾虛患者胃黏膜損傷有重要意義，為臨床推廣應(yīng)用該方治療胃病、預(yù)防胃黏膜損傷提供了實驗依據(jù)。但中藥復(fù)方對胃黏膜的保護作用是多方面的，還有待于進一步的研究。